傅聰，周月鵬，尹超云，凌銳，浦希，湯翔，陳德玉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 腫瘤治療中心； 2. 腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室； 3. 血管外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

三陰性乳腺癌即雌激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2和孕激素受體均陰性，是一種具有高侵襲性、高耐藥性、進(jìn)展快、預(yù)后差且缺乏明確治療靶點(diǎn)的亞型[1]，占所有病例的10%～15%，患者死亡率較其他類型高2.6倍[2-3]。研究表明，乙酰輔酶A在惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用。異常高表達(dá)的乙酰輔酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2，ACSS2)作為關(guān)鍵調(diào)控酶，參與食管癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的放療抵抗，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[4]；宮頸癌細(xì)胞中ACSS2可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺乏(1%血清培養(yǎng)條件)誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移和侵襲[5]；同樣，腎細(xì)胞癌患者腎臟病理組織中ACSS2高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展、侵襲行為及不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。然而ACSS2在三陰性乳腺癌中具體作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以MDA-MB-468細(xì)胞為研究對(duì)象，基于siRNA技術(shù)研究ACSS2在三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖以及凋亡發(fā)生中的作用，探討磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱 AKT)信號(hào)通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞株購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；MCF-10A細(xì)胞專用培養(yǎng)基(瑞士Lonza公司)；RNA提取試劑盒(上海奕杉生物科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；鼠抗人ACSS2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ki-67、cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；HRP標(biāo)記的抗小鼠或抗兔二抗(北京索萊寶科技有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；CCK-8以及Annexin V-FITC/7-AAD凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；針對(duì)ACSS2的特異性干擾RNA(siRNA-ACSS2)及無序序列的陰性對(duì)照(siRNA-NC)由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，siRNA-ACSS2序列： 5′-UAUGCUUGGUGACAGGCU CAUCUCC-3′，siRNA-NC序列：5′-GCGACGAUCUGC CUAAGAUdTd -3′。

細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(德國(guó)Heraeus公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像機(jī)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；Mx3000p 熒光定量 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) Stratagene公司)；紫外分光光度儀(美國(guó)Thermo公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)；流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及 0.1 mg/mL鏈霉素的L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基，正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞株用專用培養(yǎng)基，均于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)ACSS2 mRNA表達(dá)

按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA，并使用紫外分光光度儀分析其純度及濃度。按照試劑盒說明書操作方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。ACSS2上游引物：5′-GGATTCCAGCTGCAGTCTTC-3′，下游引物：5′-CAGCCAGCTCCTTCAGGTT-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。按照反應(yīng)試劑盒說明書在冰上配制反應(yīng)體系 20 μL：10 μL TB Green PremixExTaq(Tli RNaseH Plus)、上下游引物各0.4 μL、0.4 μL ROX Reference Dye、2 μL DNA模板和6.8 μL滅菌水。95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共循環(huán) 40 次；退火：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。循環(huán)結(jié)束后記錄各樣品Ct值結(jié)果，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照基因。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞分組如下：空白對(duì)照組(正常培養(yǎng))、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染siRNA-ACSS2)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-468細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前一天，將2×105的細(xì)胞種于6孔板，待密度達(dá)到40%～50%時(shí)，加入5 μL siRNA(陰性對(duì)照組加入siRNA-NC；實(shí)驗(yàn)組加入siRNA-ACSS2)和 5 μL Lipo2000TM混合液，補(bǔ)齊培養(yǎng)基至最終體積為 2 mL/孔，孵育8 h；更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ACSS2、PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白、增殖相關(guān)蛋白Ki-67和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取“1.4”分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以2×105個(gè)/孔密度種于6孔板，待24 h細(xì)胞貼壁，棄上清液，PBS 清洗2次；每孔加入50～100 μL蛋白裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，置于冰上孵育5 min，每15 min將EP管混勻，重復(fù)3次；4 ℃，12 000×g離心30 min，收集上清液；加入4×上樣緩沖液，混勻后 100 ℃煮10 min。取5～10 μL上樣，60 mA恒流電泳30 min；利用濕轉(zhuǎn)法100 V恒壓轉(zhuǎn)移30～100 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用5%牛血清白蛋白封閉1 h；TBST洗3次；加入一抗ACSS2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ki-67、cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax(TBST稀釋，均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入對(duì)應(yīng)HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(TBST稀釋，均為1 ∶1 000) ；室溫孵育1 h；TBST洗膜3次；曝光顯影，Image J軟件用于灰度分析。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取“1.4”分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以2×103個(gè)/孔密度種于96孔板。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h；加入5 mg/mL的CCK-8試劑10 μL并混勻，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h；波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量光密度(D)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞增殖活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值)/(對(duì)照孔D值-空白組D值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

取“1.4”分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以2×105個(gè)/孔種于6孔板，孵育至細(xì)胞貼壁后進(jìn)行由Lipo2000TM介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h重新計(jì)數(shù)，以每管收集3×105個(gè)細(xì)胞置入流式管中，按照Annexin V-FITC/7-AAD凋亡試劑盒說明書，將5×緩沖液稀釋成1×工作液，取300 μL重懸細(xì)胞，每管加入 5 μL Annexin V-FITC和10 μL 7-AAD，室溫避光孵育10 min；選擇最低的上樣速度于流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。每組重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 ACSS2在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中呈高表達(dá)

結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中ACSS2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞(t=15.14，21.2，P均<0.01)。見圖1。

圖1 qRT-PCR和蛋白印跡法分別檢測(cè)MDA-MB-468和MCF-10A細(xì)胞中ACSS2 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2 鑒定siRNA干擾ACSS2效果

qRT-PCR和蛋白印跡法結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中ACSS2mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下降(t= 31.73，26.88，P均<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 qRT-PCR和蛋白印跡法鑒定ACSS2干擾效果

2.3 siRNA-ACSS2抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

CCK-8法結(jié)果顯示，干擾ACSS2處理24、48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組明顯下降(t=5.056、5.324、13.240，P均<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較陰性對(duì)照組明顯上升(t= 9.215，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖3 CCK-8法檢測(cè)各組MDA-MB-468細(xì)胞增殖能力變化

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡率變化

2.4 siRNA-ACSS2降低細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)并增加PI3K/AKT信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

蛋白印跡法結(jié)果顯示干擾ACSS2表達(dá)后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT表達(dá)量較陰性對(duì)照組均明顯下降(P均<0.01)；Ki-67和Bcl-2蛋白表達(dá)量也較陰性對(duì)照組均明顯下降(P均<0.01)，而cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量明顯上升(P均<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間無明顯差異(P均>0.05)。見圖5。

a: P<0.01，與陰性對(duì)照組比較圖5 蛋白印跡法檢測(cè)各組MDA-MB-468細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的乙酸鹽可經(jīng)腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)的ACSS2利用，催化形成乙酰輔酶A，通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；揎?，進(jìn)一步激活調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等特定基因表達(dá)或激活相關(guān)信號(hào)通路[7]。前期研究表明，ACSS2蛋白在胃癌[8]、宮頸癌[5]、食管癌[4]、腎癌[6]中呈不同程度高表達(dá)。本研究表明，無論是轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平，三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中ACSS2表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞，與上述研究相一致。進(jìn)一步證實(shí)ACSS2利用糖酵解途徑代謝產(chǎn)生的乙酸鹽合成乙酰輔酶A，并在一系列酶促反應(yīng)下合成脂肪酸作為細(xì)胞能量來源及合成原料[9]，而正常細(xì)胞的能量代謝方式并不依賴ACSS2。

Zhang等[6]研究表明，下調(diào)ACSS2蛋白表達(dá)可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Wang等[10]研究表明，在肝癌細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)ACSS2第一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)表達(dá)增加，使組蛋白釋放的醋酸酯去乙?；黾雍颂求w產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究表明，靶向干擾ACSS2表達(dá)可抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖，并下調(diào)增殖相關(guān)Ki-67蛋白的表達(dá)水平，從而可能進(jìn)一步延緩腫瘤發(fā)展，可能與細(xì)胞核內(nèi)組蛋白去乙?；嘘P(guān)。由此提示，ACSS2沉默可能與抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。

凋亡是細(xì)胞程序性停止生長(zhǎng)和分裂的過程，其調(diào)控失敗，可致體內(nèi)受損細(xì)胞累積，導(dǎo)致癌癥發(fā)生[11]。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)依賴于一系列的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活，其中cleaved-caspase-3是具有活性的執(zhí)行蛋白酶，其可激活內(nèi)切酶導(dǎo)致DNA片段化和細(xì)胞骨架破壞等一系列引起細(xì)胞凋亡事件發(fā)生[12]。此外，細(xì)胞凋亡過程還涉及Bcl-2家族成員Bax激活，而Bcl-2可在線粒體水平對(duì)抗凋亡刺激，與Bax形成異源二聚體，進(jìn)而抑制凋亡，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。Yao等[13]研究顯示，植物提取物Wikstromol可在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中通過抑制Bcl-2、促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)以及激活Caspase-3誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡。同樣，Du等[14]研究發(fā)現(xiàn)，敲減長(zhǎng)鏈非編碼RNA DLX6的反義RNA(DLX6-AS1)可通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)Caspase-3蛋白活化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)DLX6-AS1則相反。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向下調(diào)ACSS2表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯上升，并使Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少。由此說明，ACSS2缺失可誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種惡性腫瘤中異常激活，如肝癌[15]、胰腺癌[16]及胃腸道腫瘤[17-18]等，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、黏附和胞外基質(zhì)降解等功能，參與腫瘤的全程。Yao等[13]研究顯示，Wikstromol可通過降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄水平從而抑制PI3K/AKT通路誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡。Niu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中，蠶繭中的大分子蛋白Sericin通過PI3K/AKT途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，在MDA-MB-468細(xì)胞中，靶向干擾ACSS2可通過磷酸化PI3K和AKT蛋白，活化PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。目前研究顯示，抑制ACSS2表達(dá)可降低乙酰輔酶A活性和組蛋白乙酰化，從而抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[20]。然而在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中，ACSS2、組蛋白乙?；c細(xì)胞增殖凋亡間的關(guān)系尚未明確，有待后續(xù)研究。本研究通過體外靶向下調(diào)ACSS2探究其生物學(xué)特性，但由于體外實(shí)驗(yàn)無法完全模擬體內(nèi)環(huán)境，ACSS2生物學(xué)特性有待在體內(nèi)以及組織樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，ACSS2在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中高表達(dá)；干擾ACSS2表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。