田海兵，盧大儒

1.上海市奉賢區(qū)古華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201400；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438

在全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)為單一傳染源引起的慢性傳染性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的報(bào)告，2018年全球約有1 000萬(wàn)人患有結(jié)核病，約有150萬(wàn)人死于結(jié)核相關(guān)性疾病[2]。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，我國(guó)結(jié)核病患者約占全球結(jié)核病總?cè)藬?shù)的9.7%，2017年我國(guó)結(jié)核病發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別約為83.1萬(wàn)和3.93萬(wàn)[3]。因此，早期診斷和規(guī)范化治療是降低結(jié)核病發(fā)病率和病死率的關(guān)鍵所在?；鶎俞t(yī)院在結(jié)核病的早期診斷、管理、傳報(bào)和轉(zhuǎn)診方面起關(guān)鍵性作用。然而，基層醫(yī)院在面對(duì)疑似結(jié)核病患者時(shí)，往往缺乏準(zhǔn)確、快速、特異度高的診斷方法，容易漏診[4]。因此，快速、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)對(duì)于結(jié)核病的早期診斷和治療非常重要。MTB/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(GeneXpertMTB/RIF，以下簡(jiǎn)稱為Xpert系統(tǒng))作為新的分子診斷技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床，該技術(shù)使用5種分子信標(biāo)，涵蓋了細(xì)菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因(rpoB基因)81 bp利福平(RIF)耐藥核心區(qū)(RRDR)，完成一份標(biāo)本檢測(cè)僅需2 h。Xpert系統(tǒng)不僅能夠快速檢測(cè)標(biāo)本中的MTB，而且能夠檢測(cè)rpoB基因是否存在突變，判斷MTB對(duì)RIF的耐藥性[5-6]。本研究分析了Xpert系統(tǒng)在基層醫(yī)院應(yīng)用情況，以評(píng)價(jià)該技術(shù)對(duì)結(jié)核病診斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1-9月上海市奉賢區(qū)古華醫(yī)院結(jié)核病專科門診就診的288例疑似肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，其中男154例，女134例；年齡13～82歲，平均(47.5±19.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：胸部影像學(xué)檢查符合肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)，或具有肺結(jié)核可疑癥狀(咳嗽≥2周或咯血、發(fā)熱、體質(zhì)量減輕>3 kg)及有結(jié)核患者密切接觸史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受過抗結(jié)核治療；(2)存在其他呼吸道感染。

1.2儀器與試劑 美國(guó)賽沛公司的Xpert系統(tǒng)及其配套試劑；美國(guó)BD公司的BACTEC MGIT320全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱MGIT320)及配套試劑；MPT64MTB抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司；Ziehl-Neelsen抗酸染色液、L-J固體培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 用潔凈的痰瓶收集所有研究對(duì)象清晨第一口痰，每例患者收集3份標(biāo)本，每份標(biāo)本2 mL痰液，收集后立即送檢，2～8 ℃保存，并在3 d內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3.2痰涂片抗酸染色鏡檢(AFB) 按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃 痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]，取無菌棉簽攪拌痰液使其充分混勻，每份標(biāo)本涂3張玻片，干燥后進(jìn)行痰涂片AFB。鏡下未見抗酸桿菌判斷為陰性，見抗酸桿菌判斷為陽(yáng)性，并根據(jù)抗酸菌量多少判為4+、3+、2+、1+、≤9條/300個(gè)高倍視野。

1.3.3MTB培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 液體培養(yǎng)：取1份痰液標(biāo)本用N-乙?；鵏-半胱氨酸(NALC)NaOH消化液進(jìn)行消化，去污染，接種于MGIT320培養(yǎng)管中。儀器出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警后取出，經(jīng)AFB后證實(shí)為抗酸菌，同時(shí)用MPT64抗原檢測(cè)，并記錄出現(xiàn)陽(yáng)性的天數(shù)。藥敏試驗(yàn)：對(duì)所培養(yǎng)的陽(yáng)性菌鑒定后如為MTB，采用MGIT320配套的藥敏試劑盒，按說明書進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并記錄結(jié)果。

1.3.4Xpert系統(tǒng)檢測(cè) 將痰液標(biāo)本用含有異丙醇和NaOH的標(biāo)本處理液(SR)消化處理，痰液和處理液的比例為1∶2，旋渦振蕩20 s，室溫靜置15 min，用配套的滴管取2 mL消化液裝入反應(yīng)盒中，將反應(yīng)盒裝載入儀器，全自動(dòng)儀器完成提取和擴(kuò)增。MTB數(shù)量按MTB-DNA拷貝數(shù)高低分為高、中、低、極低、未檢出5個(gè)量級(jí)，RIF耐藥性檢測(cè)結(jié)果為敏感或者耐藥。

1.3.5質(zhì)量控制 上海市奉賢區(qū)古華醫(yī)院檢驗(yàn)科參加上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核實(shí)驗(yàn)室每年兩次MTB涂片鏡檢、藥敏試驗(yàn)和MTB分子診斷技術(shù)能力驗(yàn)證工作，成績(jī)合格；本研究中的相關(guān)操作由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員同時(shí)操作，確保檢測(cè)質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1剔除研究對(duì)象情況 在疑似肺結(jié)核患者中，排除2例培養(yǎng)后AFB判斷為污染標(biāo)本的患者，5例患者標(biāo)本MGIT320培養(yǎng)后經(jīng)AFB見抗酸桿菌，但MPT64 MTB抗原檢測(cè)結(jié)果為陰性，判斷可能為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，或存在MPT64蛋白編碼區(qū)變異，最終281例疑似肺結(jié)核患者納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2.2痰涂片AFB、MGIT320培養(yǎng)、Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性率比較 281例疑似肺結(jié)核患者中，痰涂片AFB陽(yáng)性為44例，陽(yáng)性率為15.7%；MGIT320培養(yǎng)陽(yáng)性74例，陽(yáng)性率為26.3%；Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性為80例，陽(yáng)性率為28.5%。Xpert系統(tǒng)檢測(cè)和痰涂片AFB，以及痰涂片AFB和MGIT320培養(yǎng)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.41、9.65，P<0.05)。而Xpert系統(tǒng)檢測(cè)與MGIT320培養(yǎng)的陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.322，P>0.05)。

2.3痰涂片AFB、Xpert系統(tǒng)的檢測(cè)性能比較 以MGIT320培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Xpert系統(tǒng)、痰涂片AFB檢測(cè)結(jié)果計(jì)算靈敏度、特異度、PPV、NPV。Xpert系統(tǒng)檢測(cè)的靈敏度為90.5%(67/74),特異度為93.7%(194/207)。痰涂片AFB檢測(cè)的靈敏度為51.4%(38/74)，特異度為97.1%(201/207)。痰涂片AFB與Xpert系統(tǒng)檢測(cè)的靈敏度、NPV、一致性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.57、16.84和15.42，P<0.05)，而特異度、PPV比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.70、0.149，P>0.05)。見表1、2。

表1 痰涂片AFB、MGIT320培養(yǎng)、Xpert系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表2 痰涂片AFB與Xpert系統(tǒng)檢測(cè)性能比較[%(95%CI)]

Xpert系統(tǒng)檢測(cè)與MGIT320培養(yǎng)之間的一致性為92.9%，Kappa值為0.85，具有高度的一致性。不一致性方面，13例Xpert系統(tǒng)檢測(cè)為陽(yáng)性標(biāo)本，但MGIT320培養(yǎng)為陰性，在這13例中，AFB有5例為陽(yáng)性，并有10例疑似肺結(jié)核患者臨床診斷為肺結(jié)核并接受了抗結(jié)核治療癥狀得到改善，3例為陳舊性病灶，顯示出Xpert系統(tǒng)具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力。

2.4Xpert系統(tǒng)檢測(cè)與痰涂片AFB量級(jí)的比較 281例疑似肺結(jié)核患者標(biāo)本中，經(jīng)Xpert系統(tǒng)檢測(cè)評(píng)定為高、中、低、極低、未檢出5個(gè)等級(jí)的例數(shù)分別為9、27、21、23、201例，經(jīng)AFB評(píng)定為4+、3+、2+、1+、≤9條/HP和陰性的例數(shù)分別為5、2、14、17、12、230例。見表3。

表3 Xpert系統(tǒng)與痰涂片AFB各等級(jí)量級(jí)的比較(n)

2.5Xpert系統(tǒng)檢測(cè)與MGIT320培養(yǎng)+藥敏分析結(jié)果比較 在281例疑似患者中，Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性為80例，其中5例檢測(cè)為RIF耐藥。MGIT320培養(yǎng)陽(yáng)性為74例，藥敏分析結(jié)果顯示RIF耐藥為6例。見表4。

表4 Xpert系統(tǒng)檢測(cè)與MGIT320培養(yǎng)+藥敏分析結(jié)果比較(n)

2.63種方法陽(yáng)性檢出時(shí)間比較 Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為2 h；痰涂片AFB報(bào)出陽(yáng)性結(jié)果平均耗時(shí)為4 h(包括涂片、干燥、染色、鏡檢過程)；MGIT320培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為(12.0±5.5)d；培養(yǎng)42 d無MTB生長(zhǎng)則報(bào)告為陰性。培養(yǎng)后藥敏分析還需要(8.2±4.3)d。

3 討 論

2010年，WHO認(rèn)可并推廣Xpert系統(tǒng)在全球結(jié)核病高發(fā)國(guó)家使用[8]。與MGIT320培養(yǎng)比較，Xpert系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求比較低，人員簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可上崗操作，檢測(cè)時(shí)間為2 h，被視作第一個(gè)MTB檢測(cè)的即時(shí)檢驗(yàn)技術(shù)(POCT)，基層醫(yī)院及社區(qū)衛(wèi)生中心也可開展[9-10]。

本研究結(jié)果顯示，在281例疑似肺結(jié)核患者中，痰涂片AFB陽(yáng)性44例，陽(yáng)性率為15.7%；MGIT320培養(yǎng)陽(yáng)性74例，陽(yáng)性率為26.3%；Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性80例，陽(yáng)性率為28.5%。Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于痰涂片AFB和MGIT320培養(yǎng)。以MGIT320培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert系統(tǒng)檢測(cè)的靈敏度為90.5%，特異度為93.7%；痰涂片AFB檢測(cè)的靈敏度為51.4%，特異度為97.1%，這與國(guó)內(nèi)外多篇研究結(jié)果相似[11-14]，顯示出Xpert系統(tǒng)對(duì)肺結(jié)核診斷具有較高的靈敏度和特異度。痰涂片AFB和MGIT320培養(yǎng)陽(yáng)性率較Xpert系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性率低的原因主要是方法學(xué)的局限性，每毫升標(biāo)本需要5×103～1×104個(gè)細(xì)菌才能檢出，而Xpert系統(tǒng)每毫升痰標(biāo)本僅需131個(gè)細(xì)菌就能檢出[5,12]。當(dāng)Xpert系統(tǒng)檢測(cè)等級(jí)越低，AFB出現(xiàn)陰性的概率越大。而MGIT320培養(yǎng)只能檢出活菌，前處理時(shí)，4%NaOH液化痰液的同時(shí)可能會(huì)殺死MTB，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。而且，MGIT320培養(yǎng)并不能區(qū)分MTB還是NTM，通過MPT64 MTB抗原檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性菌，有5例MPT64 MTB抗原檢測(cè)為陰性，Xpert系統(tǒng)檢測(cè)皆為陰性，說明Xpert系統(tǒng)對(duì)區(qū)分NTM有較高的參考價(jià)值。Xpert系統(tǒng)檢測(cè)的局限性主要是不能區(qū)分死菌還是活菌。

RIF耐藥性是耐多藥性結(jié)核病(MDR-TB)的關(guān)鍵指標(biāo)，95%的RIF耐藥突變發(fā)生在rpoB基因81 bp RRDR。Xpert系統(tǒng)的5個(gè)探針覆蓋該突變區(qū)，從而能夠快速檢測(cè)出耐藥信息[15]。MGIT320培養(yǎng)+藥敏分析檢測(cè)出6例耐藥，而Xpert系統(tǒng)檢測(cè)出5例耐藥，具有高度的一致性，大樣本數(shù)據(jù)比較也得到證實(shí)[16]。不一致的原因可能是非rpoB基因突變導(dǎo)致，尚需加大樣本量測(cè)序方法予以確認(rèn)突變類型。從檢測(cè)時(shí)間上看，Xpert系統(tǒng)檢測(cè)只需要2 h即可檢測(cè)出RIF耐藥性，而MGIT320培養(yǎng)+藥敏分析總共需要約20.5 d，顯示出Xpert系統(tǒng)具有較大的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，Xpert系統(tǒng)在結(jié)核病檢測(cè)方面具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度、特異度高等優(yōu)勢(shì)，不但能夠準(zhǔn)確檢出含菌量低的標(biāo)本，對(duì)NTM感染也有較高的參考價(jià)值，同時(shí)還能檢測(cè)出RIF耐藥的情況。因此，Xpert系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)非常適合在基層醫(yī)院開展，在結(jié)核病的早期診斷、轉(zhuǎn)診、治療方面具有重要價(jià)值。