昝香存，李正玲，?，摤?，董海濱，高 崇，韓留鵬，郭 瑞，趙明忠，胡 琳，許為鋼

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子育種研究院/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

1BL/1RS易位系在中國小麥品種中分布廣泛[1]。黑麥1R染色體短臂(1RS)上攜帶有很多抗病基因[2-4]，同時具有很好的豐產(chǎn)性和適應(yīng)性[5-6]；然而，由于1RS上Sec-1位點編碼的γ-黑麥堿、ω-黑麥堿會引起小麥面團耐揉性減弱、面團發(fā)黏、加工品質(zhì)變劣等問題[7-9]，在一定程度上限制了1BL/1RS易位系在小麥遺傳改良中的廣泛應(yīng)用。

為提高1BL/1RS易位系在小麥育種中的應(yīng)用價值，可通過三種途徑來改良和提高1BL/1RS易位系的加工品質(zhì)：一是通過優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)的導(dǎo)入、聚合，可在一定程度上彌補由Sec-1位點造成的不良影響[10-12]，如HMW-GS 5+10對與1RS易位相關(guān)的面團強度損失有一定的補償作用[13]；二是通過染色體工程技術(shù)，在1RS染色體中去除引起面團發(fā)粘的Sec-1基因位點，引入有利品質(zhì)的Glu-B3/Gli-B1基因位點，保留抗病基因和與豐產(chǎn)性連鎖的基因。Koebner等[14]利用Ph1b突變體和5B染色體缺失體誘導(dǎo)1DL/1RS、1BL/1RS易位，使1RS、1DS發(fā)生重組產(chǎn)生二級重組體，獲得1DS中Gli-D1和Tri-D1分離以及1BS中Sec-1和SrR分離的重組體，產(chǎn)生的新易位系中攜帶葉銹抗性基因，還具有GLi-D1位點，取代了1RS上的Sec-1位點，對面團質(zhì)量產(chǎn)生正向效應(yīng)。Lukaszewski[15]通過同源重組法，在Attila和Hahn小麥品種中成功導(dǎo)入與面團強度相關(guān)的Gli-B3/Gli-B1位點，并去除了引起面團發(fā)粘的Sec-1位點，獲得了1RS/1RSWW(不含Sec-1，含Glu-B3/Gli-B1)近等基因系，又通過1RS與1RSWW雜交獲得1RSWR(不含Sec-1和Glu-B3/Gli-B1)/1RSRW(含Sec-1和Glu-B3/Gli-B1)近等基因系，研究結(jié)果顯示，在正常灌溉條件和水分脅迫條件下，1RS易位系的籽粒產(chǎn)量、冠層水分狀況、光合能力、生物產(chǎn)量均高于或優(yōu)于1RSWW、1RSRW，而與1RSWR易位系之間沒有差異；三是通過遺傳工程沉默ω-黑麥堿基因。柴建芳等[16]構(gòu)建了ω-黑麥堿基因沉默表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥品種金禾9123，在獲得的ω-黑麥堿基因沉默的轉(zhuǎn)基因株系中面筋指數(shù)、沉降值和穩(wěn)定時間均顯著提高,而其千粒重和產(chǎn)量均未受到不良影響。這些研究表明，聚合優(yōu)質(zhì)亞基，去除黑麥堿基因Sec-1位點、導(dǎo)入Gli-1和Glu-3位點以及沉默黑麥堿編碼位點Sec-1，都是改良1BL/1RS小麥易位系品質(zhì)的可行性技術(shù) 途徑。

1RS攜帶的抗病基因具有重要的農(nóng)藝價值，因此提高和改良1BL/1RS易位系的品質(zhì)一直是小麥育種研究的重要課題。通過染色體工程去除Sec-1位點以及去除后對抗病性和農(nóng)藝性狀影響的研究頗多，但國內(nèi)外鮮見去除Sec-1位點后對品質(zhì)影響的研究。本研究利用本課題組育成的鄭麥7698與Sec-1位點缺失的衡觀35突變體輪回雜交獲得的BC3F4和BC3F5代姊妹系為材料，研究Sec-1位點缺失易位系和正常1BL/1RS易位系之間的品質(zhì)效應(yīng)差異，以期為改良1BL/1RS 易位系的品質(zhì)，提高其在品質(zhì)育種中的利用價值提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鄭麥7698是本課題組選育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種，綜合抗性較好，聚合了品質(zhì)優(yōu)異基因Ax1/Bx7+By9/Dx5+Dy10、條銹病抗性基因Yr9/YrZH84、白粉病抗性基因Pm2/Pm4b/Pm8，是1BL/1RS易位系。Sec-1位點缺失的衡觀35突變體由中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)研究中心王道文課題組創(chuàng)制。2012年從中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)研究中心引進了Sec-1位點缺失的衡觀35突變體與鄭麥7698雜交的F1代。通過分子標記在F2代篩選獲得缺失Sec-1位點的易位系，后又2次與鄭麥7698回交，經(jīng)過連續(xù)多代選擇，獲得本研究中的BC3F4代和BC3F5代基因純合的姊妹系。2017年和2018年分別將獲得的穩(wěn)定遺傳的基因純合的株系種植在河南省農(nóng)科院試驗基地，采用隨機區(qū)組設(shè)計試驗，2次重復(fù)，每個株系種植2行，行長4 m，株距 0.03 m，行距0.20 m，同時種植鄭麥7698作為對照。田間栽培管理措施一致，保證肥水條件，并適時防治蟲害及田間雜草，不進行任何病害防治。

1.2 分子標記檢測

越冬期進行田間葉片取樣，每個株系取10株。參照CTAB法[17]提取植株葉片的基因組DNA。利用SSR標記Bmac0213,對材料進行黑麥堿編碼基因Sec-1位點進行檢測[18-19]。引物序列為Bmac0213-F：ATGGATGCAAGACCAA AC；Bmac0213-R：CTATGAGAGGTAGAGC AGCC，目的片段為524 bp。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL，Taq酶 (5 U·μL-1)0.2 μL(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(20 mmol·L-1)各0.2 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.2 μL，10×PCR緩沖液1 μL，用ddH2O補充反應(yīng)體系至10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.3 抗病性鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查

條銹病采用接種鑒定的方法，從甘肅天水農(nóng)科所訂購條銹菌混合菌種(條中32、條中33、貴22-9、貴22-4、水4和水5)，于2018年3月上旬將小麥條銹菌與滑石粉按1∶500的比例混合均勻，用抖粉法接種在株系行頭，接種后第2 d開始噴水保濕3 d；于2018年4月28日發(fā)病盛期，按照GB/T15795-200X“小麥條銹病測報技術(shù)規(guī)范”調(diào)查條銹病的發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。河南省農(nóng)科院原陽試驗基地為白粉病常年高發(fā)區(qū)域，因此白粉病是在自然發(fā)病條件下，按照NY/T 613-2002“小麥白粉病測報調(diào)查規(guī)范”于2018年5月15日調(diào)查白粉病的發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。

每個株系隨機選取10個單株調(diào)查其株高和穗粒數(shù)，成熟期適時收獲，每個株系各收1 m進行脫粒，將種子曬干后稱千粒重和總重，并計算株系的千粒重和產(chǎn)量。收獲的種子不進行藥劑熏蒸，經(jīng)后熟后進行品質(zhì)測定。

1.4 品質(zhì)性狀測定

根據(jù)籽粒水分含量和硬度計算潤麥加水量，將樣品的水分含量都調(diào)整至16%。按照AACC26-20方法，用3皮3心的布勒實驗?zāi)ブ品?。出粉率控制?0%～70%之間。將所得面粉裝入保鮮袋，放置兩周后進行品質(zhì)測定。

蛋白質(zhì)含量按照NY/T3-1982方法測定。

濕面筋含量和面筋指數(shù)用瑞典Perten公司的Glutomatic 2200面筋自動分析儀，按GB/T5506.2-2008方法測定干、濕面筋含量及面筋指數(shù)；粉質(zhì)參數(shù)用德國Brabender公司的粉質(zhì)儀(Farinograph)按GB/T14614-2006方法測定。

采用美國National MFG公司生產(chǎn)的揉面儀按照AACC54-40A方法測定和面時間、衰落值、中峰值高度、中峰值寬度、8 min尾寬等面團流變學(xué)特性。

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel對品質(zhì)指標在Sec-1位點缺失易位系和正常易位系之間進行成組數(shù)據(jù)的平均數(shù)比較，并進行T測驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 育成材料 Sec-1位點的PCR檢測結(jié)果

對不同的回交轉(zhuǎn)育后代群體進行PCR檢測，早代進行單株P(guān)CR檢測，連續(xù)多代選擇后在2017年BC3F4代選育出40個品系，其中Sec-1位點缺失易位系有26個，正常易位系有14個(圖1)。2018年對BC3F5代的40個株系進行PCR檢測，結(jié)果與2017年的一致，表明這些株系是穩(wěn)定純合的品系。

2.2 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系間蛋白質(zhì)含量和面筋品質(zhì)的差異

2017年和2018年連續(xù)二年，分別對26個Sec-1位點缺失易位系和14個正常易位系的蛋白質(zhì)含量、面筋品質(zhì)進行測定。從表1可以看出，2017年Sec-1位點缺失易位系的蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量分別為14.06%和33.74%，均略高于正常易位系；2018年Sec-1位點缺失易位系的蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量分別為13.87%和33.86%，均略低于正常易位系。兩年的成組數(shù)據(jù)T測驗結(jié)果顯示，Sec-1位點缺失易位系和正常易位系之間的蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量差異均不顯著，P值分別為0.297和0.656。2017年和2018年Sec-1位點缺失易位系與正常1Bl/1RS易位系之間的干面筋含量差異均不顯著，P值分別為 0.198和0.872。表明Sec-1位點的缺失對蛋白質(zhì)含量、干面筋含量和濕面筋含量均無顯著影響。

2017年和2018年Sec-1位點缺失易位系面筋指數(shù)分別為81.16%和80.73%，正常易位系面筋指數(shù)分別為68.07%和67.55%，兩年的變化趨勢一致，均為Sec-1位點缺失易位系面筋指數(shù)高于正常易位系，且成組數(shù)據(jù)T測驗結(jié)果顯示，二者之間的差異均達極顯著水平(P<0.01)。說明Sec-1位點的缺失有利于面筋指數(shù)的提高。

2.3 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系間粉質(zhì)參數(shù)的差異

從表1可以看出，2017年Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的吸水率分別為 64.51%和65.78%，前者極顯著低于后者；2018年Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的吸水率分別為 64.68和65.68%，二者之間的差異達顯著水平 (P<0.05)。

表1 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系之間的品質(zhì)性狀差異Table 1 Difference of grain quality traits between the Sec-1 deletion and normal translocation lines

2017年Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的形成時間分別為8.96和7.48 min，二者之間的差異達顯著水平(P<0.05)；2018年Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的形成時間分別為 9.39和6.76 min，差異達極顯著水平(P< 0.01)。

2017年和2018年Sec-1位點缺失易位系的穩(wěn)定時間分別為9.32和9.50 min，正常易位系的穩(wěn)定時間分別為7.32和6.37 min，兩年度Sec-1位點缺失易位系的穩(wěn)定時間均極顯著高于正常易位系(P<0.01)。

2017年和2018年Sec-1位點缺失易位系的粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)分別為129.11和131.11，正常易位系的粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)分別為 102.19和95.14，Sec-1位點缺失易位系均高于正常易位系，且二者之間的差異均達極顯著水平(P<0.01)。

從粉質(zhì)參數(shù)的測定結(jié)果來看，Sec-1位點缺失對粉質(zhì)參數(shù)的正向效應(yīng)作用明顯，吸水率顯著降低，面團形成時間、穩(wěn)定時間和粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)均顯著升高。

2.4 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系間揉面參數(shù)的差異

2018年對26個Sec-1位點缺失易位系和14個正常易位系的揉面參數(shù)進行測定。從表1可以看出，Sec-1位點缺失易位系的和面時間極顯著高于正常易位系；Sec-1位點缺失易位系的峰值高度為47.16 cm,略高于正常易位系，但二者之間差異不顯著；Sec-1位點缺失易位系的衰落角顯著低于正常易位系，而中峰值寬度和8 min尾寬均顯著大于正常易位系(P<0.05)。這說明Sec-1位點缺失后，面團耐柔性增強、品質(zhì)明顯 改善。

2.5 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系間抗病性和農(nóng)藝性狀的差異

2018年對26個Sec-1位點缺失易位系和14個正常易位系的抗病性和農(nóng)藝性狀進行鑒定。由表2可知，Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的條銹病病情指數(shù)分別為21.24和16.88，二者之間差異不顯著； 但Sec-1位點缺失易位系的白粉病病情指數(shù)顯著高于正常易位系(P<0.05)。說明Sec-1位點缺失使白粉病抗性顯著降低，而對條銹病抗性的影響不顯著。

表2 Sec-1位點缺失易位系和正常易位系之間抗病性和農(nóng)藝性狀差異(2018)Table 2 Difference of disease resistance and agronomic traits between the Sec-1 deletion translocation lines and normal translocation lines (2018)

Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的株高分別為79.48和78.20 cm，前者顯著高于后者 (P<0.05)。而Sec-1位點缺失易位系的千粒重、穗粒數(shù)、產(chǎn)量水平均略低于正常1BL/1RS易位系，但兩者之間差異均未達到顯著水平，P值分別為 0.081、0.675和0.055。說明Sec-1位點缺失對株高的影響顯著，而對千粒重、穗粒數(shù)和產(chǎn)量水平的影響不顯著。

3 討 論

3.1 Sec-1位點缺失對蛋白質(zhì)含量和面筋品質(zhì)的影響

面筋指數(shù)是衡量面筋強度的一個重要指標，眾多研究表明，蛋白質(zhì)組分和面筋強度的變化與1RS相關(guān)[20-22]。在1BL/1RS易位系與非1BL/1RS系的品質(zhì)對比研究中，發(fā)現(xiàn)1BL/1RS易位主要影響蛋白質(zhì)(面筋)質(zhì)量，而對蛋白質(zhì)(面筋)數(shù)量的影響較小[7]。本研究利用Sec-1位點缺失突變體與鄭麥7698(1BL/1RS易位系)三次回交，系譜法輔助分子標記連續(xù)多代選擇，建立了Sec-1位點缺失易位系和正常易位系的近等基因系，品質(zhì)測定結(jié)果表明，Sec-1位點缺失易位系與正常易位系之間的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量和干面筋含量無顯著差異，而Sec-1位點缺失易位系面筋指數(shù)明顯提高，且與正常易位系之間差異達極顯著水平，說明Sec-1位點去除后，面筋強度明顯增強。這與柴建芳等[16]利用ω-黑麥堿基因沉默株系研究蛋白質(zhì)含量和面筋品質(zhì)的變化結(jié)果一致。Graybosch等[21]研究表明，1RS的存在可顯著改變蛋白質(zhì)組成的變化。面粉中蛋白質(zhì)組成比例的改變是造成品質(zhì)不良、面筋強度減弱的主要原因[20-21]，尤其是不溶性谷蛋白大聚體含量的減少是引起面筋強度減弱的關(guān)鍵因素[20,23-24]。在本研究所獲得的Sec-1位點缺失的易位系中，可能由于Sec-1位點缺失導(dǎo)致水溶性Secalin蛋白的含量降低，不溶性谷蛋白大聚體的含量升高，最終導(dǎo)致面筋指數(shù)明顯升高。本研究的不足之處是沒有測定不同品系之間的Secalin蛋白和不溶性谷蛋白大聚合體的含量，因此，關(guān)于ω-黑麥堿對面筋強度的弱化作用機理值得進一步研究。

3.2 Sec-1位點缺失對粉質(zhì)參數(shù)和揉面參數(shù)的影響

1RS臂的引入使得1BL/1RS易位系的吸水率增加[7]，而吸水率的增加與粘性面團的形成有關(guān)[25]。本研究所獲得的Sec-1位點缺失易位系比正常易位系的吸水率顯著降低，這可能會在一定程度上消除易位系的面團粘性，從而改善面團機械化加工操作性能。Sec-1位點缺失后，其編碼的γ-黑麥堿和ω-黑麥堿受到抑制，而黑麥堿是一種水溶性單體蛋白[25]，大量吸水后又很快溶解，使面團的吸水性增大、持水性降低，致使面團發(fā)粘。從本研究結(jié)果來看，Sec-1位點缺失后，可改善1BL/1RS易位系面團發(fā)粘的加工品質(zhì)缺陷。

1BL/1RS易位對粉質(zhì)參數(shù)和揉面參數(shù)的影響明顯，尤其是對穩(wěn)定時間、和面時間、衰落角、峰值寬度等指標影響大[7,26-27]。本研究所獲得的Sec-1位點缺失的易位系，其面團形成時間、穩(wěn)定時間、粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)、和面時間、峰值寬度和8 min尾寬等指標均顯著提高，可見Sec-1位點缺失后，易位系的面團品質(zhì)得到提高和改善，正向作用顯著。

3.3 Sec-1位點缺失對抗病性和農(nóng)藝性狀的影響

1RS臂攜帶抗病基因Lr26、Sr31、Yr9和Pm8[2-3]，對提高小麥產(chǎn)量有積極影響[1,15]。前人利用誘導(dǎo)同源重組技術(shù)開展了Sec-1位點缺失易位系的創(chuàng)制和遺傳應(yīng)用研究[14，28]，嘗試多位點易位重組改良1BL/1RS易位系，緩解由于1RS的導(dǎo)入帶來的關(guān)于小麥加工質(zhì)量下降的問題。本研究利用Sec-1位點缺失的突變體與鄭麥7698(1BL/1RS易位系)多次回交，目的是想獲得既要去除Sec-1位點，又要保留抗病基因的新材料，對所獲得的Sec-1位點缺失易位系的抗病性和農(nóng)藝性狀進行了鑒定，結(jié)果表明，Sec-1位點缺失易位系的條銹病和白粉病抗性均降低，但條銹病抗性與正常易位系之間差異不顯著，而白粉病抗性差異則達顯著水平；對農(nóng)藝性狀的鑒定結(jié)果表明，Sec-1位點缺失對千粒重、穗粒數(shù)、產(chǎn)量水平的影響均不顯著。此外，本研究中Sec-1位點缺失易位系的不同株系間條銹病和白粉病的表型存在差異，條銹病病情指數(shù)變異范圍為11.37～38.12(文中未列出)，白粉病病情指數(shù)的變異范圍為19.48～38.99(文中未列出)，這可能與缺失編碼抗病基因的Sec-1片段大小，或遺傳交叉重組過程中易位斷點有關(guān)[28-29]。這也說明通過有效的篩選，可以得到既有Sec-1位點缺失，也有條銹病和白粉病抗性基因的易位系材料。

本研究選用的鄭麥7698聚合了品質(zhì)優(yōu)異基因Ax1/Bx7+By9/Dx5+Dy10、條銹病抗性基因Yr9/YrZH84、白粉病抗性基因Pm2/Pm4b/Pm8，利用Sec-1位點缺失的突變體與鄭麥7698多次回交來進一步提高和改善其加工品質(zhì)，既消除和減少1RS帶來的加工品質(zhì)缺陷，同時保留易位系的固有優(yōu)點，其結(jié)果對小麥品質(zhì)遺傳改良具有一定的指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

Sec-1位點的缺失對面筋指數(shù)、面團形成時間、穩(wěn)定時間、粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)、和面時間、中峰值寬度和8 min尾寬的正向作用明顯，對改善和提高品質(zhì)效果顯著，而對產(chǎn)量的影響不明顯，這說明Sec-1位點缺失突變體是研究和改良小麥籽粒品質(zhì)的優(yōu)良遺傳材料，利用其進行品質(zhì)遺傳改良是可行的技術(shù)途徑。