王立光,葉春雷,陳 軍,李進(jìn)京,李靜雯,羅俊杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

作物長(zhǎng)期單一種植往往引起土壤理化性質(zhì)、土壤自毒作用和微生物群落變化，從而不利于植株生長(zhǎng)與產(chǎn)量，造成連作障礙[1-3]。輪作是克服連作障礙的有效種植模式之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[4-7]。有研究表明，輪作不僅可以改善土壤酶活性，降低土壤自毒作用，還影響土壤微生物群落的多樣性和豐度，從而影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量[4, 8-12]。也有研究證實(shí)，連作制度的強(qiáng)化可以在減少農(nóng)藥投入的情況下利于雜草和土壤養(yǎng)分治理，從而提高農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的盈利能力及環(huán)境改善效果[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，胡麻(Linumusitatissimum)作為我國(guó)西北和華北黃土高原地區(qū)重要的油料作物，其連作會(huì)導(dǎo)致連作障礙發(fā)生[9]。胡麻連作導(dǎo)致土壤水提液自毒作用顯著加強(qiáng)，導(dǎo)致種子萌發(fā)降低、植株生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)量降低，并對(duì)部分土壤酶活性造成不利影響，與土壤養(yǎng)分、酶活性呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)[14-17]。而胡麻輪作小麥可以減弱土壤水提液對(duì)胡麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的自毒作用，并有利于維持土壤酶活性，與土壤養(yǎng)分及酶活性呈顯著正相關(guān)，消減胡麻連作障礙的發(fā)生，利于胡麻生產(chǎn)[9, 18]。目前，關(guān)于小麥輪作消減胡麻連作障礙的研究雖然在土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性及土壤自毒作用等方面已經(jīng)取得部分成果，但胡麻-小麥輪作更替過(guò)程中土壤細(xì)菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化的研究少有報(bào)道，因此，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)胡麻-小麥輪作更替土壤內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)定，研究輪作更替過(guò)程中土壤細(xì)菌群落變化，以期從細(xì)菌群落變化角度解析胡麻-小麥輪作消減連作障礙機(jī)制，從而為胡麻連作障礙消減提供理論依據(jù)，為胡麻產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及樣地概況

胡麻試驗(yàn)品種為隴亞10號(hào)，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供。種植地點(diǎn)為甘肅省榆中縣試驗(yàn)地(104°06′35.27″ E， 35°50′36.06″ N)，海拔1 600 m，屬于黃土高原丘陵溝壑半干旱高寒區(qū)，年均降水量約450 mm，樣地區(qū)域土壤類型為黃綿土。試驗(yàn)地為澆灌地，胡麻生育期充分澆灌2次。

1.2 田間試驗(yàn)處理

田間試驗(yàn)設(shè)置胡麻-小麥輪作更替樣地，分別為第一年胡麻種植(TC1)、第二年小麥輪作(TR)和第三年胡麻種植(TC2)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，每樣區(qū)面積30 m2(6 m×5 m)。小區(qū)間用寬60 cm、高50 cm土埂分割，以防小區(qū)間互相影響。

1.3 土壤樣品采集

試驗(yàn)樣地作物栽培管理與當(dāng)?shù)卮筇镒魑锵嗤醋鎏厥馓幚?。收獲期分別采集第一年種植胡麻、第二年小麥輪作和第三年胡麻種植地根際土壤，采用“S”型布點(diǎn)對(duì)土壤樣品進(jìn)行采集，保證6個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)采樣土壤充分混合，剔除枯葉、腐葉等，每小區(qū)獲得土樣2份。每種處理的3個(gè)平行土樣充分混合，最終每種處理獲得土壤樣本2個(gè)，用四分法取適量土樣放入無(wú)菌自封袋，迅速置于干冰上保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 土壤樣品DNA提取及高通量測(cè)序

準(zhǔn)確稱取土樣0.1 g，按照土壤微生物DNA提取試劑盒(MOBIO PowerSoil?DNA Isolation Kit：12855-50)說(shuō)明步驟分別提取各土樣的總DNA，Drop2000測(cè)定提取獲得的DNA濃度和純度,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。設(shè)計(jì)帶有barcode的融合引物，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增特異性引物序列為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。擴(kuò)增后利用2.0%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、并切膠回收PCR產(chǎn)物，利用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)，按照樣本測(cè)序量要求，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，合格樣品交由美吉生物醫(yī)藥科技公司進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為PE300。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序結(jié)束后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)量過(guò)濾處理，從而得到優(yōu)化序列，進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Uniits)聚類分析、物種組成分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種差異分析及功能預(yù)測(cè)分析。其中，序列拼接利用FLASH、序列過(guò)濾利用QIME，聚類利用UPARSE pipeline軟件，功能預(yù)測(cè)采用Tax4Fun進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序樣本稀釋曲線分析

對(duì)樣本測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與其對(duì)應(yīng)的OTU的數(shù)目繪制稀釋性曲線(圖1，見(jiàn)87頁(yè))。圖1表明，隨著序列數(shù)的增加，各土壤樣本的稀釋曲線斜率變小，趨于平坦，更多的測(cè)序序列讀取只能產(chǎn)生少量新的OTU，貢獻(xiàn)率較小，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序結(jié)果已可以真實(shí)反映各土壤樣本細(xì)菌群落指標(biāo)。

2.2 土壤細(xì)菌OTU分布Venn圖

優(yōu)化測(cè)序結(jié)果后共獲得237750條有效序列，按97%相似度歸并后通過(guò)OTU聚類分析得到1870條OTU。對(duì)各測(cè)序土樣得到的OTU進(jìn)行分類表明，3類樣品中共有的OTU為1625條，TC1、TR和TC2分別具有特異OTU為20、11和36條，僅TC1和TR共有的OTU為61條，TC1與TC2共有而TR沒(méi)有的OTU為50條，TC1不具有而TR和TC2共有的OTU為67條(圖2)。

2.3 土壤細(xì)菌物種多樣性分析

采用Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)不同根際土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性進(jìn)行分析，從而反映細(xì)菌群落的豐度和多樣性。由表1可知各樣本文庫(kù)覆蓋率均大于99.4%，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果能夠真實(shí)反映各樣本的細(xì)菌群落組成。不同處理的Shannon指數(shù)表現(xiàn)為TC1>TR>TC2， Simpson指數(shù)表現(xiàn)為TC2>TR>TC1，細(xì)菌群落豐度(Chao指數(shù)和Ace指數(shù))則表現(xiàn)為TC1>TR>TC2，說(shuō)明在輪作更替過(guò)程中細(xì)菌多樣性和豐度都是降低的。

表1 土壤樣本中細(xì)菌的Alpha多樣性分析Table 1 Alpha bacteria diversity statistical in soil samples

2.4 土壤細(xì)菌物種豐富度分析

樣本檢測(cè)出的細(xì)菌主要分布在33個(gè)門，75個(gè)綱，143個(gè)目，263個(gè)科，433個(gè)屬，811個(gè)種。以門分類水平對(duì)土壤細(xì)菌分析發(fā)現(xiàn)，TC1、TR和TC2土壤具有的細(xì)菌門數(shù)分別為33、33、32個(gè)，其中有32個(gè)細(xì)菌門為三者所共有，TC1和TR土壤內(nèi)的Peregrinibacteria菌門在TC2土壤內(nèi)未檢測(cè)到(圖3A)。如圖3B所示，根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度>0.01)分析發(fā)現(xiàn)，3種土壤內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門種類相同、數(shù)目相同(均為11個(gè))，但各樣本內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的相對(duì)豐度存在差異。變形菌門(Proteobacteria)在TC1和TC2處理下的豐度占比最高，其相對(duì)豐度分別為31.65%和28.53%，而在TR處理下其相對(duì)豐度為24.52%，在輪作更替中表現(xiàn)為先降低再升高。酸桿菌門(Acidobacteria)在TR處理下豐度占比最高，其相對(duì)豐度為26.13%，其在TC1和TC2處理下的豐度占比分別為19.36%和11.18%，表現(xiàn)為先升高再降低。放線菌門(Actinobacteria)在TC1和TR土壤內(nèi)的相對(duì)豐度接近，分別為12.14%和13.79%，但在TC2處理下相對(duì)豐度為22.82%，明顯高于TC1和TR。綠灣菌門(Chloroflexi)在TC1、TR和TC2中的相對(duì)豐度分別為9.69%、12.68%和10.53%，與酸桿菌門相似，都表現(xiàn)為先升高再降低，但TC1和TC2處理下的相對(duì)豐度較接近。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在TC1處理下相對(duì)豐度為8.04%，而輪作小麥后相對(duì)豐度降低至5.41%，再次胡麻種植后相對(duì)豐度上升至6.01%。后壁菌門(Firmicutes)在TC2根際土壤內(nèi)相對(duì)豐度為12.63%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TC1(3.29%)和TR(1.32%)處理下的相對(duì)豐度，種植更替中其變化規(guī)律為先降低后急劇上升。TC1和TR根際土壤內(nèi)擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度接近，分別為7.04%和7.11%，而在TC2處理下根際土壤的相對(duì)豐度僅有2.89%。硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度在更替種植土壤內(nèi)表現(xiàn)為逐漸降低，其相對(duì)豐度依次為3.01%、1.81%、1.52%。浮霉菌門(Planctomycetes)和 疣微菌門(Verrucomicrobiae)的變化趨勢(shì)與綠灣菌門一致，都是先升高再降低，且TC1和TC2內(nèi)相對(duì)豐度幾乎相同。Latescibacteria菌門在輪作更替根際土壤內(nèi)的相對(duì)豐度為TR(1.23%)>TC1(0.92%)>TC2(0.38%)，其變化規(guī)律與酸桿菌門類似。

2.5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果的主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)發(fā)現(xiàn)，輪作更替根際土壤細(xì)菌群落豐度差異較明顯。如圖4A所示，土壤PC1貢獻(xiàn)率為67.46%，PC2的貢獻(xiàn)率為26.1%，TC1分布在PC1和PC2的負(fù)值區(qū)域，且分布相對(duì)集中，而TR分布于PC1的負(fù)值區(qū)域和PC2的正值區(qū)域，分布也相對(duì)集中，TC2聚集到PC1正值區(qū)域及PC2的正負(fù)值區(qū)域，分布較遠(yuǎn)?；赪eighted Unifrac距離矩陣進(jìn)行聚類分析，如圖4B所示，TC1和TR聚為一類，TC2單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明TC1和TR根際土壤細(xì)菌群落差異相對(duì)較小，而輪作小麥后再次種植胡麻使根際土壤細(xì)菌群落差異變大。

2.6 土壤細(xì)菌群落Tax4Fun功能預(yù)測(cè)分析

Tax4Fun可以將基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S分類譜系轉(zhuǎn)化為KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)原核生物的分類譜系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行KEGG功能注釋，基于此，可獲得OTU在KEGG各功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本內(nèi)的豐度信息。為探究胡麻-小麥輪作更替過(guò)程中根際土壤細(xì)菌變化情況，本研究采用Tax4Fun軟件進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析(表2)。測(cè)序獲得功能基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所有細(xì)菌的基因序列在第一等級(jí)上注釋到6類功能，分別為新陳代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)和人類疾病，其中新陳代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理作為主要組成位居前3類，其占比分別為61.30%～62.70%、11.33%～11.36%和18.45%～19.13%。二級(jí)功能預(yù)測(cè)分析顯示，其包含碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜運(yùn)輸、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、折疊、分類與降解、能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等41個(gè)子功能組成。其中涉及新陳代謝的有11項(xiàng)，涉及環(huán)境信息處理功能的3項(xiàng)，涉及遺傳信息處理功能的4項(xiàng)，涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、有機(jī)系統(tǒng)和人類疾病的子功能分別為5項(xiàng)、8項(xiàng)、10項(xiàng)。

表2 土壤樣本細(xì)菌群落功能基因的KEGG豐度Table 2 Abundance chart of KEGG of functional genes for soil samples

3 討論與結(jié)論

土壤微生物在土壤養(yǎng)分吸收轉(zhuǎn)化和作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色，而土壤細(xì)菌是土壤微生物群落中的重要群體，在群落中起著重要作用。我們前期已經(jīng)對(duì)胡麻-小麥輪作中的土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性及土壤自毒作用等進(jìn)行了研究，但關(guān)于輪作更替過(guò)程中土壤細(xì)菌群落變化的研究并未進(jìn)行，也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[14,16,17,19]。王芳等[20]對(duì)不同輪作方式下大豆根際細(xì)菌的研究表明，輪作作物種類、輪作順序等對(duì)土壤細(xì)菌多樣性都會(huì)產(chǎn)生影響。尹國(guó)麗等[21]的研究顯示，輪作時(shí)間和輪作作物對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響是普遍的。這些結(jié)果表明輪作模式在消減連作障礙的過(guò)程中不僅與土壤酶活性、土壤自毒作用有關(guān)，還與土壤微生物群落存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，胡麻-小麥輪作種植更替過(guò)程中，土壤細(xì)菌的豐度和多樣性都是逐漸降低的，但TC1和TR土壤內(nèi)根際土壤細(xì)菌差異較小，且優(yōu)勢(shì)菌門保持相對(duì)穩(wěn)定，而與TC2土壤內(nèi)細(xì)菌差異較大。這種變化差異也與報(bào)道的胡麻-小麥輪作條件下植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量的變化差異相一致[9,15]。這也說(shuō)明，胡麻-小麥輪作模式下土壤細(xì)菌群落變化很可能是影響消減連作障礙的又一因素。

在連作過(guò)程中，土壤內(nèi)細(xì)菌群落差異隨連作年限增加而改變，但也受連作作物的影響而存在差別。但眾多研究結(jié)果表明，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠灣菌門等一般都包含在優(yōu)勢(shì)菌門內(nèi)[22-24]。苜蓿、大豆和硒砂瓜連作研究表明，隨著連作時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門和主要菌門的數(shù)量沒(méi)有改變，但菌門豐度發(fā)生較大改變，也就說(shuō)明連作障礙發(fā)生伴隨著菌門豐度變化，這也被認(rèn)為是導(dǎo)致連作障礙的主要因素之一[22-23,25]。本研究顯示在胡麻-小麥輪作更替過(guò)程各土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門相同，并未由于小麥輪作改變優(yōu)勢(shì)菌門數(shù)量和種類。同時(shí)，小麥輪作使優(yōu)勢(shì)菌門與TC1內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門豐度保持相近，變化較小，而與TC2土壤內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門豐度有較大差別，尤其是放線菌門、酸桿菌門和后壁菌門。主坐標(biāo)分析顯示，在更替種植土壤內(nèi)，代表TC1和TR的細(xì)菌群落分布距離較近，而代表TC2的細(xì)菌群落分布距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明TC2群落結(jié)構(gòu)存在較顯著差異。進(jìn)一步的聚類分析顯示，相同更替年限的平行樣品聚集在一個(gè)分支，且TC1和TR分支較近，而TC2單獨(dú)處于一個(gè)分支，與TC1和TR間聚類水平降低，表明TR細(xì)菌菌門所占比例、菌群結(jié)構(gòu)組成與TC1相似。這些結(jié)果說(shuō)明小麥輪作不是通過(guò)改變優(yōu)勢(shì)菌門數(shù)量，而是通過(guò)維持細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門和主要菌門的穩(wěn)定性而消減下茬胡麻連作障礙的發(fā)生。這也暗示細(xì)菌群落的變化應(yīng)該是導(dǎo)致胡麻連作障礙的一個(gè)重要因素。

種植模式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響，往往會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落功能組成的改變，而土壤細(xì)菌群落功能組成與土壤環(huán)境關(guān)系密不可分[26-28]。研究證實(shí)，胡麻殘茬根、莖及葉水提液都具有明顯的自毒效應(yīng)，在胡麻種植過(guò)程中，這些自毒物質(zhì)往往會(huì)通過(guò)不同形式進(jìn)入土壤，造成毒害，使土壤水提液表現(xiàn)出明顯的自毒作用[17,19,29]。本研究通過(guò)Tax4Fun對(duì)細(xì)菌群落的功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在輪作更替過(guò)程中，一級(jí)功能層上細(xì)菌群落在遺傳信息處理功能上幾乎沒(méi)有差異，但是在新陳代謝、環(huán)境處理和細(xì)胞過(guò)程功能方面存在差異，這可能與土壤內(nèi)自毒物質(zhì)的變化有關(guān)，因此后續(xù)有必要對(duì)各土壤內(nèi)自毒物質(zhì)種類及含量進(jìn)行測(cè)定，從而解析細(xì)菌群落功能差異變化。本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析了胡麻-小麥輪作條件下根際土壤細(xì)菌群落的豐度及其變化規(guī)律，并對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，這些將為改良胡麻種植技術(shù)及解決種植中連作障礙的發(fā)生提供理論依據(jù)。