孫艷華 李明 徐建立 董路 曹學(xué)彬 孟小晶

摘要 目的：研究紫草素通過激活活性氧（ROS）自由基誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：通過MTT測(cè)定法檢測(cè)紫草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480細(xì)胞活力的影響，結(jié)合Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;通過Caspase 3/9活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)半胱天冬酶活性，使用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)紫草素處理對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞中ROS水平的影響，并借助Western Blotting檢測(cè)Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460對(duì)紫草素干預(yù)不敏感，而紫草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480細(xì)胞活力表現(xiàn)出顯著的抑制作用（均P<0.05）。在紫草素干預(yù)后，Western Blotting分析檢測(cè)到細(xì)胞周期蛋白D、c-Myc、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（均P<0.05）。同時(shí)，紫草素以劑量依賴性方式上調(diào)了Caspase3和Caspase9蛋白表達(dá)水平（均P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)10 μmol/L紫草素處理24 h后，HCT116和SW480細(xì)胞凋亡率增加至59.2%和65.6%，而幾乎沒有壞死細(xì)胞（Annexin V-，PI+）;并檢測(cè)到HCT116和SW480細(xì)胞線粒體膜電位被去極化。ROS水平檢測(cè)結(jié)果顯示，紫草素以劑量依賴性方式上調(diào)了HCT116和SW480細(xì)胞ROS水平。結(jié)論：紫草素通過線粒體介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，Bcl-2蛋白家族和細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高在該過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 紫草素;結(jié)腸癌;活性氧;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖;細(xì)胞活力;Bcl-2家族蛋白;線粒體

Shikonin by Activating Reactive Oxygen Species ROS to Inducing Apoptosis in Colorectal Cancer Cells

SUN Yanhua，LI Ming，XU Jianli，DONG Lu，CAO Xuebin，MENG Xiaojing

（Cangzhou People′s Hospital，Cangzhou 061000，China）

Abstract Objective：To study the molecular mechanism of shikonin by activating reactive oxygen species ROS to induce apoptosis of colorectal cancer cells.Methods：The effect of shikonin on the viability of human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 was detected by MTT assay，combined with Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and flow cytometry to detect cell apoptosis; by Caspase 3/9 activity assay kit and caspase activity were was detected.ROS detection kit was used to detect the effect of shikonin treatment on the ROS levels in HCT116 and SW480 cells，and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL proteins was detected by Western Blotting.Results：Cell viability test results showed that human normal colonic mucosal epithelial cell line NCM460 was not sensitive to shikonin intervention，while shikonin showed a significant inhibitory effect on human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells（P<0.05）.Western Blotting detected cyclin D and c-Myc，and Bcl-2 and Bcl-xL protein levels were significantly down-regulated after shikonin intervention（P<0.05）.Meanwhile，shikonin increased the expression levels of Caspase3 and Caspase9 protein in a dose-dependent manner（P<0.05）.Flow cytometry results showed that after treated with 10 μmol/L shikonin for 24 h，the apoptosis rate of HCT116 and SW480 cells increased to 59.2% and 65.6%，with almost no necrotic cells（Annexin V-，PI+）; Mitochondrial membrane potentials to HCT116 and SW480 cells were depolarized.ROS levels showed that shikonin up-regulated ROS levels in HCT116 and SW480 cells in a dose-dependent manner.Conclusion：Shikonin induces apoptosis of colon cancer cells through mitochondria-mediated pathway，and Bcl-2 protein family and intracellular ROS levels play an important role in this process.

Keywords Shikonin; Colon cancer; Reactive oxygen species; Cell apoptosis; Cell Proliferation; Cell viability; Bcl-2 family protein; Mitochondria

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.018

結(jié)腸癌是目前世界范圍內(nèi)高發(fā)性癌癥之一，其中發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，主要?dú)w因于不健康的飲食以及肥胖[1]。隨著社會(huì)高速發(fā)展，結(jié)腸癌確診病例在我國呈現(xiàn)高速增長趨勢(shì)[2]。已有研究報(bào)道，紫草素可有效抑制乳腺癌、肝癌和肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬[3-6]。但是紫草素誘導(dǎo)自噬的作用機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡是限制惡性細(xì)胞成活和傳播的天然過程[7]?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）作為腫瘤生物學(xué)的重要研究指標(biāo)，一方面，氧化應(yīng)激直接參與了腫瘤生長，轉(zhuǎn)移;另一方面，細(xì)胞內(nèi)ROS的累積會(huì)對(duì)細(xì)胞器的蛋白質(zhì)、酶和質(zhì)膜系統(tǒng)造成損害，最終激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[8-10]。因此，增加氧化應(yīng)激是選擇性殺死癌細(xì)胞的重要治療策略。本研究旨在闡明外源性氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在紫草素誘導(dǎo)大腸癌HCT116和SW480細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，以期將紫草素開發(fā)為結(jié)腸癌治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480，以及正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：CZRMYY-JCSY-1903-N018）。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)于CO2濃度為5%，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.1.2 藥物 紫草素（Sigma-Aldrich公司，美國，貨號(hào)：hc10871），溶解于二甲基亞砜（DMSO）中使用。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)基（ThermoFisher公司，美國，貨號(hào)：A4192302）。ZVAD-FMK（MedChemExpress公司，美國，貨號(hào)：161401-82-7），碘化丙啶緩沖液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：ST512），N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0077），L-谷胱甘肽（GSH）（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0077）。Caspase 3/9活性測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C1115/C1158），ROS檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0033M），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C1075M），Pierce BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Thermo Scientific公司，美國，貨號(hào)：23225）?？贵wBcl-2（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號(hào)：15071），抗體Bcl-xL（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號(hào)：2764），抗體BAX（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號(hào)：89477），抗體Caspase 3（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號(hào)：9662），抗體Caspase 9（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號(hào)：9508），抗體β-actin（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab8226），抗體c-Myc（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab32072），抗體Cyclin D（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab141070），抗體Cyclin E（Abcam公司，英國，貨號(hào)：ab33911），辣過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司，美國，貨號(hào)：sc-47778），山羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國，貨號(hào)：sc-2357）。FACS流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，加拿大，貨號(hào)：343020）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國，型號(hào)：51030993），酶標(biāo)儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美國，型號(hào)：168-1130），電泳系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美國，型號(hào)：BJ005269）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活力測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作方案使用MTT測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞活力。具體操作步驟為：將細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用不同濃度的藥物處理特定時(shí)間。處理好的細(xì)胞用MTT（5 mg/mL）溫育4 h，并在除去上清液后用DMSO溶解。最后，在酶標(biāo)儀中490 nm處測(cè)量吸光度。實(shí)驗(yàn)分組包括：1）不同濃度梯度紫草素處理對(duì)SW480、HCT116和SW480細(xì)胞成活率影響實(shí)驗(yàn)，紫草素濃度設(shè)置0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L;2）5 μmol/L紫草素處理3組細(xì)胞不同時(shí)間梯度對(duì)細(xì)胞成活率影響實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間設(shè)置0、6、12、18、24、30、36 h。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測(cè) 將SW480細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中12 h，然后用不同濃度紫草素處理24 h。使用FACS流式細(xì)胞儀在具有RNase的碘化丙啶緩沖液存在的情況下進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡分析 將HCT116和SW480細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板板中12 h，然后用對(duì)應(yīng)試劑處理24 h，收獲細(xì)胞并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次。通過Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒及FACS流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組：紫草素濃度設(shè)置：0、2.5、5、10 μmol/L。

1.2.4 Caspase 3及Caspase 9活性檢測(cè) 根據(jù)操作說明使用Caspase 3/9活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)半胱天冬酶活性。具體操作步驟為：將細(xì)胞置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中12 h，用試劑處理24 h，收獲并重懸于裂解緩沖液中。將細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，并通過底物和酶之間的相互作用評(píng)估半胱天冬酶活性。

1.2.5 Western Blotting檢測(cè) 將細(xì)胞或腫瘤組織懸浮于Laemmli緩沖液中。蛋白質(zhì)濃度使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。等量蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)移膜。用TBST中的5%新鮮脫脂牛奶封閉膜，并在4 ℃下與TBST中的特異性一抗孵育過夜。將膜用TBST洗滌3次，并在室溫下與第二抗體溫育2 h。最后，使用ECL試劑盒進(jìn)行曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片。實(shí)驗(yàn)分組包括：1）不同濃度紫草素處理對(duì)Cyclin D，Cyclin E和c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響，紫草素濃度設(shè)置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）不同濃度紫草素處理對(duì)Caspase3和Caspase9蛋白表達(dá)水平的影響，紫草素濃度設(shè)置：0、10、20、30 μmol/L;3）不同濃度紫草素處理對(duì)Bcl-2、Bcl-xL和BAX蛋白表達(dá)水平的影響，紫草素濃度設(shè)置：0、10、20、30 μmol/L。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 使用ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS。具體操作步驟為：將細(xì)胞置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中12 h，用試劑處理12 h，并在37 ℃及黑暗中與DCFH-DA探針溫育。通過流式細(xì)胞儀測(cè)量DCF熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)分組：1）不同濃度梯度紫草素處理對(duì)ROS水平的影響，紫草素濃度設(shè)置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）抗氧化劑NAC或GSH干預(yù)再接受紫草素處理對(duì)ROS水平、凋亡率、Caspase 3和Caspase 9活性的影響，其中DMSO組只經(jīng)DMSO處理;SHK組只接受紫草素處理;SHK+NAC組經(jīng)NAC干預(yù)，并接受紫草素處理;SHK+GSH組經(jīng)GSH干預(yù)，并接受紫草素處理。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為闡明Bcl-2家族蛋白在紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，首先，在GV316質(zhì)粒中構(gòu)建Bcl-2和Bcl-xL過表達(dá)質(zhì)粒。Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)質(zhì)粒由Genechem Institute（中國上海）合成。使用Thermo Fisher Scientific的Lipofectamine TM 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。其次，通過Western Blotting檢測(cè)過表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞中的過表達(dá)情況;其中，Control組轉(zhuǎn)染GV316質(zhì)粒;GV316-Bcl-2組轉(zhuǎn)染GV316 Bcl-2過表達(dá)質(zhì)粒;GV316-Bcl-xL組轉(zhuǎn)染GV316 Bcl-xL過表達(dá)質(zhì)粒。按1.2.3所述實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)Bcl-2和Bcl-xL過表達(dá)SW480細(xì)胞再接受紫草素處理的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)分析;其中，Control組轉(zhuǎn)染GV316質(zhì)粒，不經(jīng)紫草素處理;SHK組轉(zhuǎn)染GV316質(zhì)粒，并接受紫草素處理;SHK+Bcl-2組轉(zhuǎn)染GV316 Bcl-2過表達(dá)質(zhì)粒，并接受紫草素處理;SHK+Bcl-xL組轉(zhuǎn)染GV316 Bcl-xL過表達(dá)質(zhì)粒，并接受紫草素處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism ver.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用 結(jié)果表明，紫草素以劑量依賴性方式抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，同時(shí)，紫草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480的抑制活性顯著高于人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460（P<0.05）。這表明，紫草素對(duì)殺死腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出一定選擇性。同時(shí)本研究也確定了紫草素處理的時(shí)間依賴效應(yīng)。結(jié)果表明，紫草素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，SW480的抑制效果隨時(shí)間依賴性增加，并且人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞系NCM460對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的增加仍然不敏感，更接近其隨時(shí)間延長的自然生長狀態(tài)。Western Blotting分析檢測(cè)到參與G1期的細(xì)胞周期蛋白D和c-Myc受紫草素處理影響，其蛋白表達(dá)明顯減少。見圖1。

2.2 紫草素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，經(jīng)濃度梯度紫草素處理后，HCT116和SW480誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率明顯增加，而幾乎沒有壞死細(xì)胞（Annexin V-，PI+）。同時(shí)，HCT116和SW480細(xì)胞經(jīng)ZVAD干預(yù)后，也沒有觀察到壞死比例增加的現(xiàn)象。此外，早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+，PI-）的比例隨著ZVAD的共同處理而降低，表明紫草素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。Caspase3和Caspase9的Western Blotting檢測(cè)到紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中半胱天冬酶裂解的劑量呈依賴性作用。這些結(jié)果表明，紫草素激活了Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.3 由線粒體介導(dǎo)紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用?? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，HCT116和SW480細(xì)胞在紫草素濃度梯度處理后，其線粒體膜電位被去極化。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)隨著紫草素的處理呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但沒有發(fā)現(xiàn)其中BAX的顯著變化。為了進(jìn)一步闡明Bcl-2家族在紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建了Bcl-2和Bcl-xL的過表達(dá)體系，再經(jīng)紫草素處理，Bcl-2或Bcl-xL過表達(dá)觀察組的細(xì)胞凋亡率降低。這些數(shù)據(jù)表明紫草素通過激活結(jié)腸癌細(xì)胞中的線粒體介導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖3。

2.4 ROS水平在紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用?? ROS水平檢測(cè)結(jié)果表明，紫草素劑量依賴性地促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。NAC和GSH是2種常規(guī)抗氧化劑，通過與紫草素共同處理發(fā)現(xiàn)，NAC或GSH可以阻斷紫草素依賴性細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時(shí)，使得細(xì)胞凋亡率顯著降低。此外，結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase 3和Caspase 9活性在抗氧化劑NAC或GSH作用下明顯降低，而紫草素誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化效果也因NAC或GSH作用而減弱。以上結(jié)果表明，紫草通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和活化線粒體介導(dǎo)的凋亡通路來實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。見圖4。

3 討論

癌癥是全球性公共衛(wèi)生問題，盡管在癌癥早期診斷和治療方面已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但許多患者仍死于化療藥物耐藥性引起的疾病復(fù)發(fā)[11]。因此，新藥研發(fā)能為結(jié)腸癌治療提供了更多可選方案。紫草素已被證實(shí)具有抗腫瘤治療效果[12-13]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫草素以劑量依賴的方式有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，其中的細(xì)胞周期蛋白是紫草素抗癌作用的靶點(diǎn)之一，這與紫草素在乳腺癌細(xì)胞相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果類似[14]。已有的紫草素安全性相關(guān)研究報(bào)道中，也證實(shí)紫草素對(duì)非腫瘤細(xì)胞的毒性極小，例如胃上皮細(xì)胞系GES-1[15]和正常人肝細(xì)胞系L02[5]。綜合本研究結(jié)果，紫草素是具備進(jìn)一步發(fā)展臨床應(yīng)用價(jià)值的結(jié)腸癌治療藥物。

腫瘤藥物抗性的潛在機(jī)制主要?dú)w因于抗細(xì)胞凋亡途徑，癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性取決于促凋亡信號(hào)和抗細(xì)胞凋亡信號(hào)之間的平衡。死亡受體介導(dǎo)途徑和線粒體介導(dǎo)途徑是2種主要的凋亡途徑[16]。紫草素已被證實(shí)為許多腫瘤中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑[15]。細(xì)胞凋亡是經(jīng)遺傳編碼的程序性細(xì)胞死亡，這對(duì)于機(jī)體在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17-18]。已有研究報(bào)道中，紫草素通過誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，包括凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤效果[19]。本研究結(jié)果表明，紫草素以劑量依賴的方式誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480細(xì)胞系凋亡，而并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的壞死細(xì)胞（Annexin V-，PI+）。此外，泛半胱天冬蛋白酶抑制劑ZVAD在本研究中顯示出有效降低早期凋亡細(xì)胞比例的作用，進(jìn)一步證實(shí)紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而非細(xì)胞壞死性凋亡。

線粒體介導(dǎo)凋亡途徑作為主要的凋亡途徑之一，Bcl-2家族蛋白在其中發(fā)揮著重要作用[20-21]。本研究對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞的線粒體膜電位的檢測(cè)表明，在紫草素處理后線粒體膜電位去極化，并且通過Bcl-2或Bcl-xL的過表達(dá)可抵消部分去極化作用。盡管作為線粒體凋亡蛋白的具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究，但Bcl-2家族成員在調(diào)節(jié)紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。而進(jìn)一步對(duì)半胱天冬蛋白酶的檢測(cè)結(jié)果表明，紫草素增加了Caspase3和Caspase9的活性。以上結(jié)果證實(shí)，紫草素在結(jié)腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)Bcl-2家族的線粒體凋亡程序。

與正常細(xì)胞比較，腫瘤細(xì)胞具有更高的代謝和氧化應(yīng)激，更容易受外源因子誘導(dǎo)的ROS水平變化影響[22]。因此，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平有望作為一種選擇性殺死癌細(xì)胞的策略。細(xì)胞內(nèi)ROS的積累包括2種來源，其一是異常代謝產(chǎn)生，另外還可以通過外源性藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生。ROS積累可以激活線粒體依賴性凋亡[23-24]，紫草素誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞中ROS的累積已有研究報(bào)道[25]。基于細(xì)胞內(nèi)ROS將不發(fā)熒光的DCFH探針氧化成可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的DCF熒光探針，便于檢測(cè)紫草素處理對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞中ROS水平的影響。目前的一些化療藥物通過直接產(chǎn)生ROS，或通過破壞抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。本研究結(jié)果表明，紫草素以劑量依賴性地提高結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。為了闡明紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中ROS水平變化機(jī)制，進(jìn)一步評(píng)估了2種抗氧化劑，NAC和GSH抗氧化劑有效改善了紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和半胱天冬蛋白酶活化。此外，NAC和GSH抵消了紫草素誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化和Bcl-2或Bcl-xL表達(dá)降低。這表明在紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中，ROS作用于線粒體介導(dǎo)通路上游。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ROS的積累，下調(diào)了Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，線粒體膜電位的去極化，以及半胱天冬蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活保證了紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明紫草素具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的能力。紫草素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡由線粒體介導(dǎo)，并受Bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié);細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高在紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。結(jié)合已有紫草素安全性相關(guān)研究結(jié)果，紫草素可以作為人類結(jié)腸癌的潛在治療候選藥物。

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（2020-05-20收稿 責(zé)任編輯：楊燕）

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（20191249）

作者簡介：孫艷華（1981.05—），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腸胃疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床診治，E-mail：DrMaJcang@126.com