呂邵娃，黃雨婷，劉玉甜，郭玉巖，周 金，李永吉*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江鶴翔制藥有限責任公司，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

細菌性陰道炎（bacterial vaginosis，以下簡稱BV）疾病的對象多為已婚女性，是臨床常見的一種婦科疾病，中醫(yī)學的研究重點領域一般認為，BV的臨床致病性和危害范圍屬“陰癢”“帶下病”[1]。其主要病因是“濕”邪侵入機體，或肝經(jīng)濕熱侵襲下體，或由濕腐生蟲、蟲邪直犯陰器所導致。根據(jù)女性生理結(jié)構(gòu)的特殊性，常用外治法治療BV，獨特性在于促使藥物直達病灶，發(fā)揮藥效，抑制毒邪生長，加快機體腸黏膜對藥物的吸收[2-3]。同抗生素類藥物對比，中藥制劑無明顯的耐藥性。散結(jié)乳癖消貼膏（國藥準字：Z20040073）是由莪術、姜黃、白芷、急性子、天葵子、木鱉子6味中藥組成，具有行氣活血、散結(jié)消腫的作用，用于氣滯血瘀所致的乳癖。臨床使用發(fā)現(xiàn)其可以有效地抑制引起感染的致病菌[4]，如白色念珠菌等其它相關致病菌。本實驗所用藥物為消癥散結(jié)栓，是經(jīng)過中醫(yī)辨證論治對散結(jié)乳癖消貼膏的二次開發(fā)[5]，在原處方的基礎上，增加了一味藤黃藥材，藤黃具有消腫、攻毒、祛腐斂瘡、殺蟲的功效，此新型栓劑擬用于治療具有炎癥反應的陰道感染性疾病。本實驗采用金黃色葡萄球菌-白色念珠菌混合液建立BV大鼠模型，通過考察消癥散結(jié)栓改善大鼠BV 的功效及相關病理學分析，來驗證消癥散結(jié)栓對BV大鼠的治療作用，為臨床治療 BV 提供新型藥物。

1 材料

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量為200 ～260 g，購于青島大任實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（遼）2015-0001。動物實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（編號：RL15008）。

1.2 實驗試劑

消癥散結(jié)栓（自制） ；消糜栓（批號：Z20025663，通化萬通藥業(yè)有限公司）；苯甲酸雌二醇（批號：20160101，天津必佳藥業(yè)集團有限公司）；金黃色葡萄球菌（BNCC 186335）、白色念珠菌（BNCC 186382）、前列腺素2（PGE2）、前列腺素 2α（PGF2α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）均購自于上海江萊生物有限公司；PBS液（美國康寧公司）；ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器

Labo LB-2004型電子分析天平（藍博惠科有限公司）；CKX31-A12PHP型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SB-5200D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；BJ-2CD型垂直凈化工作臺（上海博訊儀器有限公司）；ZHP-100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精其儀器有限公司）。

2 方法

2.1 BV 小鼠模型制備

配制濃度為0.5麥氏濃度的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的菌懸液。按1∶1的比例進行混合，配制成感染菌液。取自然狀態(tài)下健康的雌性大鼠，于第1、3和5天對大鼠皮下注射10 mg/kg的苯甲酸雌二醇注射液。無菌緩沖液清洗大鼠陰道3次后吸取適量的混合菌液，輕緩的插入大鼠陰道約1 ～ 1.5 cm處，每日接菌量為0.5 mL/kg, 連續(xù)7 d。菌株接種后，每日觀察大鼠陰道變化情況。當大鼠陰道外觀出現(xiàn)明顯充血、發(fā)紅、變腫且有大量白色黏性分泌物時，取分泌物進行涂板觀察及培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察，可見大量的壞死細胞和細菌，平板內(nèi)大量菌株生長旺盛，表明大鼠陰道的環(huán)境已被菌株破壞，大鼠BV模型建立成功。

2.2 實驗分組及給藥方法

按照“2.1”項下方法，向陰道注入細菌7 d后全部呈現(xiàn)陰道炎癥狀，表明造模成功。將模型大鼠隨機分為6組，每組10只，即空白組、模型組、消癥散結(jié)栓高劑量組、消癥散結(jié)栓中劑量組、消癥散結(jié)栓低劑量組以及陽性藥組。除空白組及模型組不予處理外，消癥散結(jié)栓高、中、低劑量組分別按200、100、50 mg/kg的劑量給藥。陽性藥組則以消糜栓100 mg/kg陰道給藥。連續(xù)給藥14 d，于末次給藥24 h后，磷酸鹽緩沖液充分的灌洗大鼠陰道，收集灌洗液于無菌管中。次日處死大鼠，將大鼠陰道及子宮等組織進行剝離保存，用于檢測炎癥因子含量及相關病理學檢查。

2.3 ELISA 法檢測小鼠陰道分泌物中炎癥因子

用無菌膠頭滴管吸取適量PBS緩沖液，伸入雌鼠陰道內(nèi)，收集各實驗組的大鼠的陰道灌洗液。剪取大鼠子宮組織，經(jīng)研磨、裂解、勻漿、離心，取上清液，相關處理后，按試劑盒說明進行操作。

2.4 HE染色考察大鼠陰道組織病變程度

取大鼠部分陰道組織，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、切片（4 μm），HE染色后，置于顯微鏡下，進行大鼠陰道組織的病理學分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對BV大鼠陰道口外觀的影響

與空白組比較，模型組大鼠陰道口處發(fā)紅、腫脹，可見白色黏性的陰道分泌物，少數(shù)出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象；消癥散結(jié)栓的高、中劑量組及陽性藥組的大鼠外陰均恢復正常的外觀。陰道粘膜光滑,無潰病及糜爛,結(jié)構(gòu)清楚。消癥散結(jié)栓的低劑量組陰道外觀有輕度充血、紅腫,有少量膿性分泌物。

3.2 BV大鼠模型的陰道組織切片HE染色

通過HE 染色進行病理學檢查，結(jié)果表明, 空白組黏膜上皮光滑、無壞死組織脫落、固有層為致密結(jié)締組織，未見充血水腫及炎細胞浸潤；模型組陰道壁變厚，上皮細胞壞死，固有層出現(xiàn)充血和水腫，以中性粒細胞為主，淋巴細胞和單核細胞炎細胞浸潤，纖維細胞增生明顯，說明該模型造模成功；與模型組比較，消癥散結(jié)栓高、中、低劑量組、陽性藥組病理組織切片中，中性粒細胞浸潤均不同程度減少，陰道黏膜上皮細胞不同程度增厚，尤其是消癥散結(jié)栓高、中劑量組陰道組織切片中黏膜完整、粘膜下組織基本恢復正常。結(jié)果見圖1。

圖1 各組陰道組織的HE染色結(jié)果比較（200×）Fig.1 Comparison of HE staining results of vaginal tissue in each group（200×）

3.3 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子分泌的影響

用ELISA 法檢測大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的TNF-α、IL-6以及IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，消癥散結(jié)栓各劑量組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05），且消癥散結(jié)栓高劑量組作用更加明顯，消癥散結(jié)栓中、高劑量組優(yōu)于陽性藥組，結(jié)果見表1。

表1 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響±s，n = 5）Tab. 1 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in vaginal secretions of BV rats±s，n = 5）

表1 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響±s，n = 5）Tab. 1 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in vaginal secretions of BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05,##P＜0.01。

空組白別組（劑mg-量/k g/）2.8 T9N±F 0-.α 0 4** 2.74 I L±-0 6.4 5** 3.1 I2L±- 10β.28*模型組 - 3.85 ± 0.43## 4.39 ± 0.64## 3.72 ± 0.33#消癥散結(jié)栓50 3.19 ± 0.23*# 2.85 ± 0.13** 3.16 ± 0.16**低劑量組消癥散結(jié)栓100 2.89 ± 0.11** 2.66 ± 0.41** 2.98 ± 0.33**中劑量組消癥散結(jié)栓200 2.81 ± 0.26** 2.32 ± 0.47** 2.91 ± 0.18**高劑量組陽性藥組 100 3.02 ± 0.01**## 2.74 ± 0.14** 2.84 ± 0.19**#F 16.878 18.227 5.247 P 0.000 0.000 0.001

3.4 消癥散結(jié)栓對BV大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β炎癥因子分泌的影響

用ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β水平，結(jié)果顯示，模型組的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平高于空白組（P＜0.05）；消癥散結(jié)栓各劑量組的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平低于模型組（P＜0.05），且消癥散結(jié)栓高劑量組作用明顯，優(yōu)于陽性藥組，結(jié)果見表2。

表2 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β及水平的影響±s，n = 5）Tab. 2 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on serum levels of TNF-α, PGE2α and IL-1β in BV rats±s，n = 5）

表2 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β及水平的影響±s，n = 5）Tab. 2 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on serum levels of TNF-α, PGE2α and IL-1β in BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P< 0.05，##P < 0.01。

組別 （劑mg量/kg/） TNF-α PGE2α IL-1β空白組 - 2.07 ± 0.24** 1.94 ± 0.07* 1.81 ± 0.04*模型組 - 4.11 ± 0.65## 3.12 ± 0.96# 2.75 ± 0.90#消癥散結(jié)栓50 1.92 ± 0.12** 2.07 ± 0.33* 1.81 ± 0.12*消低癥劑散量結(jié)組栓100 1.88 ± 0.19** 1.98 ± 0.33* 1.74 ± 0.21*消中癥劑散量結(jié)組栓200 1.35 ± 0.58**# 1.91 ± 0.25** 1.69 ± 0.20**高陽劑性量藥組組 100 1.86 ± 0.11**# 1.94 ± 0.14**## 1.72 ± 0.11*F 37.661 5.247 9.360 P 0.000 0.001 0.000

3.5 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮組織中PGF2α及PGE2水平的影響

模型組的PGE2、PGE2α水平高于空白組（P＜0.05）；消癥散結(jié)栓各劑量組的PGE2、PGE2α水平低于模型組（P＜0.05），但弱于陽性藥組。結(jié)果見表3。

表3 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮PGE2、PGE2α水平的影響±s，n = 5）Tab. 3 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on PGE2 and PGE2α levels in uterus of BV rats±s，n = 5）

表3 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮PGE2、PGE2α水平的影響±s，n = 5）Tab. 3 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on PGE2 and PGE2α levels in uterus of BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

組別 劑量/（mg/kg） PGE2 PGE2α空白組 - 3.09 ± 0.38** 3.22 ± 0.29**模型組 - 4.76 ± 0.60## 3.88 ± 0.32##消癥散結(jié)栓50 3.70 ± 0.29**## 3.39 ± 0.32*低劑量組消癥散結(jié)栓100 3.31 ± 0.09** 3.28 ± 0.13**中劑量組消癥散結(jié)栓200 3.21 ± 0.26** 3.22 ± 0.22**高劑量組陽性藥組 100 3.01 ± 0.31** 3.35 ± 0.15**F 20.016 7.534 P 0.000 0.000

4 討論

女性陰道黏膜極易受到各種有害細菌的直接侵害導致感染[6-8]。其病因復雜，多種因素均可導致炎癥發(fā)生。患者病癥反復，病程較長，不易根除。臨床研究發(fā)現(xiàn)，BV患者的陰道分泌物中可檢查到致病菌的存在，同時在患者的陰道組織中有數(shù)目較大的炎癥因子存在[9]。通過對炎癥因子的檢測發(fā)現(xiàn)，常見的致病因子其中包括 TNF-α，還有白介素類，如IL-6、IL-1β，其中 TNF-α在患者感染初期便可以被檢查到，且大量存在。當TNF-α、IL-1β及IL-6大量存在時，可誘導機體前列腺素的分泌，典型的為PGE2與 PGF2α。大量的炎癥黏附因子主要存在于炎癥細胞機體，其大量存在使組織器官受損[10]。本實驗主要探討了中藥復方消癥散結(jié)栓對抗細菌性陰道炎的作用及機制。

本實驗所采用的藥物消癥散結(jié)栓是由藤黃、莪術、姜黃、白芷、急性子、天葵子、木鱉子7味中藥經(jīng)粉碎后，與適量蜂蜜混合進行發(fā)酵，后與適宜的基質(zhì)混合而組成的復方制劑。方中君藥為藤黃，現(xiàn)代藥理學研究表明，藤黃具有廣譜抗菌作用，其活性可以抑制真菌及病原蟲的生長及繁殖[11]。姜黃的藥理作用表現(xiàn)在殺菌、抗炎等，其在治療癌癥方面也有所應用。同時姜黃可以提高機體的免疫能力，對抗疾病的發(fā)生[12]。莪術及白芷均具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒等作用。相關研究證實，急性子有效部位的提取物可以通過抑制相關蛋白的表達，同時誘導細胞凋亡，從而對前列腺癌細胞的生長起到抑制作用[13]。天葵子善清熱解毒、消腫散結(jié)、利水通淋，現(xiàn)代醫(yī)學常用作預防和治療女性卵巢癌等疾病。木鱉子的現(xiàn)代研究甚少，其研究現(xiàn)狀大多為木鱉子的抗腫瘤及對癌癥的治療，其有效成分皂苷對白色念珠菌及其它真菌具有顯著的抑制作用。全方配伍，藥少力專，有消癥散結(jié)、 活血通經(jīng)、行氣止痛之功效，適用于癥瘕積聚、氣滯血瘀證。同時本藥在抑菌方面的顯著成效為新制劑的研究奠定了基礎[14]。

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，在給予BV模型大鼠消癥散結(jié)栓治療后，對比空白組與模型組間大鼠血清的相關數(shù)據(jù)，模型組的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平顯著升高，對比模型組與各給藥組之間的相關數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其中各給藥組中的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平顯著降低，各給藥組的大鼠子宮組織中， PGE2、PGF2α含量水平較模型組顯著減少。表明消癥散結(jié)栓可減少 PGF2α、PGE2水平，通過減少其表達來抑制前列腺素的分泌。多次給藥證實消癥散結(jié)栓對大鼠陰道組織無刺激性作用。通過對大鼠陰道口外觀的觀察及陰道組織切片病理學檢驗表明消癥散結(jié)栓能抗金黃色葡萄球菌、白色念珠菌感染引起的大鼠細菌性陰道炎。

5 結(jié)論

消癥散結(jié)栓對BV模型大鼠的疾病癥狀具有明顯的治療作用，其作用機制可能是通過抑制BV模型大鼠陰道內(nèi)的炎癥因子的釋放從而減少 PGF2α、PGE2水平，減少其表達來抑制前列腺素的分泌從而緩解BV的炎癥反應。因此，消癥散結(jié)栓對細菌性陰道炎治療具有一定應用價值。本實驗為治療女性陰道感染等疾病的新藥研制提供了重要的參考。