魏佳明，李 雅，郭志華，匡 琳，李 卉

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 第一中醫(yī)臨床學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410208）

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是心室充盈或射血能力受損的一組復(fù)雜綜合征，其發(fā)病率、死亡率高，造成了嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1-3]。心肌重構(gòu)是心衰臨床進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制，而心肌纖維化是心肌病理性重塑的重要基礎(chǔ)[4-5]。近年來大量研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）過度表達(dá)是導(dǎo)致心肌纖維化的主要原因之一[6-8]。益心泰由黃芪、丹參、紅花、豬苓、澤瀉等藥配伍組成，具有藥效物質(zhì)基本明確、作用機(jī)理相對(duì)清晰及安全有效、質(zhì)量可控等特點(diǎn)。研究表明，益心泰有效組分（effective components of Yixintai，ECYXT）具備抗心室重構(gòu)功能，且能保護(hù)心肌纖維[9]，但其作用機(jī)制尚不清晰。因此，本研究以兔慢性心衰模型為研究對(duì)象，采用益心泰有效組分進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)后兔心率、尿量及E/A比值等指標(biāo)的變化，并檢測(cè)心肌組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)水平，深入研究益心泰有效組分對(duì)慢性心衰兔的作用機(jī)制，為其防治心衰提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只健康新西蘭兔，普通級(jí)，體質(zhì)量為1.5 ～ 2.0 kg，雌雄各半。購(gòu)于湖南太平生物科技有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2015-0004，合格證號(hào)：NO.43608300000615。不限制食水，通風(fēng)，室溫約23℃，濕度50% ～ 60%，正常光/暗周期，分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)得到湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2018010801）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芪、丹參、紅花、豬苓、澤瀉等購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)郭志華教授鑒定，符合《中國(guó)藥典》2020年版一部規(guī)定），按照3∶1∶1.5∶1∶1配比，采用系統(tǒng)溶劑法與大孔樹脂吸附法相結(jié)合，對(duì)益心泰復(fù)方中四個(gè)不同極性部位的藥效組分進(jìn)行分離，根據(jù)最佳工藝條件，分離得到益心泰有效組分提取液，冷凍干燥得提取物（含總皂苷372.4 mg/g、總黃酮98.3 mg/g、總多糖445.8 mg/g）；氯沙坦鉀（50 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：H20000371）；丙基硫氧嘧啶（50 mg/片，蘇州東瑞制藥有限公司，批號(hào)：H32020795）；烏拉坦（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：94300）；生理鹽水（500 mL/瓶，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H51021158）。

1.1.3 試劑 多聚甲醛（批號(hào)：16005）、蘇木精（批號(hào)：H9627）、伊紅（批號(hào)：E4009）、Pluronic-F127（批號(hào)：P2443）等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；石蠟購(gòu)自河南天孚化工有限公司；TGF-β抗體（批號(hào)：#3711）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體（批號(hào)：ab181602）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；RIPA裂解液、PMSF、BSA蛋白定量試劑盒等購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR047A）、SYBR Premix EX Taq TM II（ 批號(hào)：DRR820A）等購(gòu)自日本Takara公司；TrIzol試劑（批號(hào)：15596-026）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Fluo3/AM（批號(hào)：S1056）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.4 儀器 Sequoia 512型超聲心動(dòng)圖機(jī)（德國(guó)西門子公司）；FV3000型激光掃描共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；SYSTEM GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；iQ5型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 參考文獻(xiàn)[10]，采用阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃制作心衰兔模型。根據(jù)隨機(jī)原則，將20只實(shí)驗(yàn)兔作正常對(duì)照組，余下100只進(jìn)行造模處理。固定兔于手術(shù)臺(tái)，模型兔予丙基硫氧嘧啶灌胃，劑量按兔每日進(jìn)食量的0.2%，每日1次；并分別于每周三、周日下午耳緣靜脈注射阿霉素溶液1 mg/kg，濃度為1 mg/mL。正常對(duì)照組予等次等量的生理鹽水灌胃與耳緣靜脈注射。連續(xù)造模8周。

1.2.2 干預(yù)方法 將造模成功的模型兔按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為HF模型組（17只）、益心泰有效組分低劑量組（17只）、中劑量組（17只）、高劑量組（17只）和氯沙坦鉀組（16只），另設(shè)正常對(duì)照組（20只），一共為6組。于造模后第1周開始灌胃，根據(jù)成人體表面積換算法，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和既往實(shí)驗(yàn)研究，確定益心泰有效組分低、中、高劑量組分別按照2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg，給藥前予以蒸餾水稀釋后灌胃。氯沙坦鉀組（制作成氯沙坦鉀懸液）按照2.75 mg/kg，正常對(duì)照組與HF模型組灌服同等容積的蒸餾水，各組灌胃量均為每次10 mL/kg，均每日1次，連續(xù)4周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 一般情況 觀察兔的毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、心率、尿量、水腫等一般情況。

1.3.2 E/A比值檢測(cè) 麻醉完成后將兔平臥位固定，超聲心動(dòng)圖機(jī)探頭頻率3～8 MHz，取心前區(qū)左室長(zhǎng)軸最大直徑處，M型超聲標(biāo)記室間隔和左室后壁收縮末與舒張末期心內(nèi)膜位置，隨機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算兔E/A比值，取5個(gè)心動(dòng)周期讀數(shù)平均值。

1.3.3 TGF-β mRNA檢測(cè) RT-PCR法測(cè)定心肌組織TGF-β mRNA水平，TRIzol抽提總RNA，計(jì)測(cè)OD值，檢測(cè)RNA的純度及濃度并定量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL），用去離子水1∶3稀釋后貯存于-20℃冰箱備用。引物設(shè)計(jì)與合成：TGF-β：F:5′-AACTACTGCTTCAGCTCCAC-3′；R:5′-GTAACACGATGGCGAGTGCG-3′。PCR反 應(yīng)體系：配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL），置于PCR儀中，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，步驟2—4循環(huán)40次，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為250 bP。1.3.4 TGF-β 蛋白檢測(cè) 采用Western blot法測(cè)定，液氮研磨心肌組織后，加入裂解液，冰上放置20 min，充分裂解，4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清，BCA法蛋白定量，制備SDS-PAGE濃縮膠與分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，配一抗，上一抗，上二抗，顯影成像，利用Quantity-One 圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值，以看家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算TGF-β蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值之比，并將基礎(chǔ)數(shù)值（正常對(duì)照組）設(shè)置為“1”進(jìn)行比較，從而得出各組最后結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ECYXT對(duì)慢性心衰兔一般情況的影響

用藥后，各用藥組兔毛毛色枯槁、精神萎靡、少動(dòng)少氣、水腫及心率加快、尿量減少（心率、尿量情況詳見表1）等癥狀均有所改善，以中、高劑量組和氯沙坦鉀組較明顯。HF模型組沒有明顯的改變，并且其中部分實(shí)驗(yàn)兔較前嚴(yán)重。用藥干預(yù)全過程中，HF模型組和低劑量組兔各死亡3只（均死于腹瀉），中劑量組兔死亡2只（均死于腹瀉），高劑量組、氯沙坦鉀組各死亡1只（均死于腹瀉），正常對(duì)照組無死亡。

2.2 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影響

用藥后，與正常對(duì)照組比較，HF模型組心率加快、尿量減少（P< 0.01），E/A比值下降（P< 0.01）；與HF模型組比較，各給藥組心率降低、尿量有所增加（P< 0.01），E/A比值上升（P< 0.01）；與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心率降低、尿量增加（P< 0.01），E/A比值升高（P< 0.01）；而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心率、尿量、E/A比值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），結(jié)果見表1。

表1 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影響（±s）Tab. 1 Effects of ECYXT on heart rate, urine volume and ratio of E/A in CHF rabbits（ ±s）

表1 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心率、尿量、E/A比值的影響（±s）Tab. 1 Effects of ECYXT on heart rate, urine volume and ratio of E/A in CHF rabbits（ ±s）

注：與HF模型組比較，△△P < 0.01；與益心泰有效組分低劑量組比較，**P< 0.01。

正常分 對(duì)組照組 2 n 0 21（1.2次心0 ±率/m 5 i./n9）4△△** 0.9（7尿m±L量0./0h/3）△△** 1.49 ±Em /0Am.0/4△△**HF 模型組 14 234.79 ± 5.85 0.62 ± 0.02 0.60 ± 0.02益心泰有效組分14 224.07 ± 5.48△△ 0.67 ± 0.02△△ 0.68 ± 0.02△△益心低泰劑有量效組組分15 218.07 ± 5.88△△** 0.90 ± 0.02△△** 1.22 ± 0.03△△**益心中泰劑有量效組組分16 217.13 ± 6.31△△** 0.91 ± 0.03△△** 1.23 ± 0.04△△**高劑量組氯沙坦鉀組 15 215.27 ± 5.50△△** 0.92 ± 0.03△△** 1.24 ± 0.03△△**F 31.14 584.16 1 940.07 P 0.000 0.000 0.000

2.3 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心肌組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，HF模型組TGF-β mRNA水平升高（P< 0.01）；與HF模型組比較，各用藥組TGF-β mRNA水平均降低（P< 0.01）；與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織TGF-β mRNA水平均降低（P< 0.01）；而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心肌組織TGF-β mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

與正常對(duì)照組比較，HF模型組TGF-β 蛋白表達(dá)升高（P< 0.01）；與HF模型組比較，各用藥組TGF-β蛋白表達(dá)均降低（P< 0.01）；與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織TGF-β蛋白表達(dá)均降低（P< 0.01）；而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心肌組織TGF-β蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），結(jié)果見圖1、表2。

圖1 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心肌組織TGF-β蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β protein of myocardial tissue in CHF rabbits

表2 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心肌組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab. 2 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β mRNA and protein of myocardial tissue in CHF（±s）

表2 ECYXT對(duì)慢性心衰兔心肌組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab. 2 Effects of ECYXT on the expression of TGF-β mRNA and protein of myocardial tissue in CHF（±s）

注：與HF模型組比較，△△P< 0.01；與益心泰有效組分低劑量組比較，**P< 0.01。

分組 n TGF-β mRNA TGF-β蛋白正常對(duì)照組 20 1.12 ± 0.03△△** 1.00 ± 0.03△△**HF模型組 14 3.06 ± 0.09 3.17 ± 0.09益心泰有效組分低劑量組 14 2.97 ± 0.08△△ 2.74 ± 0.08△△益心泰有效組分中劑量組 15 1.55 ± 0.05△△** 1.55 ± 0.04△△**益心泰有效組分高劑量組 16 1.53 ± 0.04△△** 1.52 ± 0.04△△**氯沙坦鉀組 15 1.52 ± 0.03△△** 1.53 ± 0.04△△**F 3 313.93 3 528.82 P 0.000 0.000

3 討論

慢性心力衰竭的重要病理機(jī)制是心肌重構(gòu)[11]，在心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展過程中TGF-β過度表達(dá)所致的心肌纖維化為其始動(dòng)因素。益心泰的臨床用藥表明其具有抗心室重構(gòu)、改善心衰的作用，組方中的黃芪、紅花、丹參等藥有明確的下調(diào)TGF-β表達(dá)，減輕心肌纖維化的功效[12-14]，且前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)TGF-β為益心泰治療心衰的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[15]。因而推測(cè)，益心泰可作用于TGF-β，減輕心肌纖維化程度，進(jìn)而達(dá)到改善心衰的效果。

本研究中HF模型組較正常對(duì)照組心率加快、尿量減少、E/A比值下降，提示CHF兔心衰的形成。從本研究結(jié)果可以看出，益心泰有效組分的使用可以提高CHF兔的心功能、改善心衰，其作用機(jī)理可能與下調(diào)TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)成纖維細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)因子的表達(dá)及調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖黏附與遷移等過程有關(guān)[16]。且益心泰有效組分中、高劑量組下調(diào)TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)能力和改善心衰療效強(qiáng)于低劑量組。

4 結(jié)論

本研究通過觀察益心泰有效組分對(duì)慢性心力衰竭兔模型的干預(yù)作用，比較了各組兔心率、尿量、E/A比值、心肌組織TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)等指標(biāo)，表明益心泰有效組分提高心功能、改善心衰的機(jī)制可能與抑制TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。考慮到心衰發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及中藥復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)的作用特性，對(duì)益心泰有效組分治療心衰的機(jī)制仍需進(jìn)行更全面、深入的研究，以便更好地應(yīng)用于臨床。