余志引， 藺磊

(1.浙江杰力惠農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 杭州 310015； 2.浙江農(nóng)藝師學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品學(xué)院，浙江 杭州 310058)

生物胺是一類非揮發(fā)性的脂肪族、脂環(huán)族或雜環(huán)類的含氮有機化合物的總稱，具有一定的生物活性，廣泛存在于生物體及多種食品中[1]。機體中適量的生物胺具有重要的生理活性，如調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、控制血壓、參與免疫反應(yīng)等[2-4]。但當(dāng)生物胺攝入過高或在體內(nèi)大量累積時則可能對機體產(chǎn)生毒性。其中，組胺是毒性最強的生物胺，攝入組胺含量為80～400 mg·kg-1的魚肉就可能產(chǎn)生輕微中毒反應(yīng)[3]，而當(dāng)攝入濃度超過1 000 mg·kg-1時便會有嚴重中毒反應(yīng)，癥狀包括嘔吐、頭暈、腹瀉、過敏等，嚴重的還可導(dǎo)致休克，甚至危及生命[5]。我國衛(wèi)生部發(fā)布的國家標(biāo)準《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準》[6]規(guī)定組胺含量鮐魚≤1 000 mg·kg-1、其他魚類≤300 mg·kg-1；而歐盟限定魚肉中組胺的平均含量≤100 mg·kg-1[7]。此外，美國FDA還將組胺含量超過50 mg·kg-1作為評判魚肉變質(zhì)的標(biāo)準[5]。因此，準確快速地檢測魚肉中組胺的含量，對保證魚肉品質(zhì)及消費者的健康安全具有重要意義。

傳統(tǒng)對于魚肉中組胺的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光定量法、離子交換色譜法、毛細管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[8-11]，這些方法雖然靈敏度較高，但由于實驗前處理繁瑣、檢測耗時較長、儀器攜帶不便和試劑價格貴等原因均具有一定的局限性。表面增強拉曼光譜(SERS)是一種高靈敏度的指紋圖譜，“表面增強”一詞是指化合物分子吸附到某些納米級粗糙金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠中，其拉曼信號成幾何倍數(shù)的增強[12-14]，因此，SERS技術(shù)能實現(xiàn)對微量樣品和單分子的快速檢測。同時，SERS具有前處理方法簡單、儀器攜帶方便且檢測速度快等優(yōu)點，在農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥的快速篩查[15]、食品中痕量物質(zhì)的檢測[16]、環(huán)境中危害物的檢測[17]等方面應(yīng)用廣泛。Gao等[18]采用分子印跡聚合物(MIPs)法結(jié)合SERS技術(shù)，以金納米粒子為增強基底，成功建立了快速檢測金槍魚罐頭中組胺含量的方法，檢測范圍為3～90 mg·kg-1；Xie等[19]采用SERS聯(lián)合薄層色譜(TLC)法建立了快速篩查魚肉中組胺的方法，其準確度和靈敏度可以媲美歐盟(EU)官方使用的HPLC；Zhang等[20]利用SERS技術(shù)分析了芽孢桿菌的生物標(biāo)志物二皮考啉酸鈣(CaDPA)的含量，結(jié)果表明以銀納米球為基底，僅5 s的數(shù)據(jù)采集便可快速分析得到相當(dāng)于104孢子量的CaDPA，顯示出SERS在環(huán)境危害物檢測方面較好的應(yīng)用前景。然而，采用SERS技術(shù)檢測新鮮魚肉中組胺含量的研究報道較少。因此，本文以石首科新鮮米魚肌肉為載體，模擬魚肉在儲存過程中組胺的變化，以金納米溶膠為基底，利用SERS技術(shù)結(jié)合密度泛函理論對魚肉中組胺含量進行定性定量分析，并用國標(biāo)法進行驗證；最后，采用SERS對4 ℃下放置了1、4、7 d的米魚肉中組胺的含量進行預(yù)測，用國標(biāo)法進行結(jié)果評判。

1 材料與方法

1.1 材料

組胺(分析純99.7%，Sigma-Aldrich)；硝酸銀、高氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、正己烷、碳酸鈉、正丁醇、氯仿、谷氨酸鈉、丙酮、乙醚、甲醇等化學(xué)實驗試劑均為分析純(上海晶純實業(yè)有限公司)；新鮮米魚由奉化興洋水產(chǎn)食品有限公司提供，捕自寧波奉化海產(chǎn)品捕撈基地，冰溫條件下12 h內(nèi)運往實驗室-20 ℃凍存。實驗用水為二次去離子水。

1.2 實驗儀器

1.3 樣品制備

內(nèi)標(biāo)液為濃度200 mg·L-1組胺標(biāo)準品。配置組胺的標(biāo)準液分別設(shè)置濃度為0.5、1、10、5、25、50、75、100 mg·L-1。制作17份米魚肉樣本，配置組胺濃度為1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、95、100 mg·L-1，預(yù)留空白樣本。

選取4 ℃下放置1、4、7 d的米魚肉各5份，參照GB/T 5009.208—2008中HPLC濃度檢測檢驗方法準確度。

取米魚背部肌肉切碎，每份5 g。樣品勻漿后按1∶5的料液比加入12%濃度的三氯乙酸，60 W功率下超聲提取15 min，3 600 r·min-1離心5 min，取上清用定量濾紙過濾，重復(fù)提取1次，合并上清液，用三氯乙酸定容至50 mL(樣本制備40 min完成，取待測液預(yù)備拉曼上機)。

除脂：取10 mL待測液于25 mL具塞試管中，加入等體積正己烷，渦旋振蕩5 min，除去有機相，重復(fù)進行2次。

萃?。簩⑸鲜龀笕芤杭尤脒m量氯化鈉使其飽和，準確移取2.0 mL于15 mL離心管中，用2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH至12，加入2.0 mL正丁醇-氯仿(1∶1)混合溶液，渦旋振蕩5 min后于3 600 r·min-1離心5 min，取上層有機相，重復(fù)萃取2次。合并萃取液，加入2滴1 mol·L-1的鹽酸并混合，于40 ℃水浴下氮氣吹干，加入0.1 mol·L-1的鹽酸1.0 mL溶解殘留物。

衍生：取上述待衍生溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，加入1.5 mL飽和碳酸鈉溶液(現(xiàn)配)和1.0 mL丹磺酰氯(10 mg·mL-1丙酮溶液)衍生溶液，振蕩混勻后于60 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，中間振蕩2次。取出后加入100 μL谷氨酸鈉(50 mg·mL-1飽和碳酸氫鈉溶液)，振蕩混勻，60 ℃保溫15 min，加入1 mL超純水，于40 ℃水浴下氮氣吹去丙酮，加入3 mL乙醚萃取，得乙醚相，重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，氮氣吹干后加入1.0 mL甲醇溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾(樣本制備7 h完成，用HPLC測定)。

胎兒期動脈導(dǎo)管開放，又無肺氣的干擾，經(jīng)連續(xù)三血管切面及弓降部冠狀切面的綜合掃查，能較快速發(fā)現(xiàn)血管環(huán)并經(jīng)弓降部冠狀切面進行確認及進一步診斷，同時可觀察氣管受壓的情況及有無其他畸形。對胎兒出生后能否得到及時、有效治療，提高胎兒存活率有重要的意義。

1.4 銀納米溶膠和金納米溶膠基底制備

金納米溶膠基底制備采用文獻[12]中的檸檬酸三鈉加熱還原法，其制作過程如下：將一定濃度的高氯金酸溶液(10 mg高氯金酸溶于200 mL超純水中)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，溫度控制在120 ℃恒定加熱至沸騰后，迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉溶液(20 mg檸檬酸三鈉溶于4 mL超純水)，同時以100 r·min-1轉(zhuǎn)速快速攪拌，制備成的金納米溶膠顏色為酒紅色。待溶液冷卻后，將上述適量膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量超純水，用超聲振蕩混勻，經(jīng)多次提純后，避光保存。

銀納米溶膠基底制備采用Lee-Meisel的檸檬酸三鈉加熱還原法，參照相關(guān)文獻[13]制作：將一定濃度的硝酸銀溶液(36 mg硝酸銀溶于200 mL超純水)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2 min內(nèi)逐步滴入濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液(60 mg檸檬酸三鈉溶于6 mL超純水)，同時以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌，此時溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25 min后得到灰綠色液體，避光保存。

1.5 高效液相色譜試驗條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；檢測器為光電二極管陣列檢測器(DAD)；流動相：A-甲醇，B-水；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜試驗梯度洗脫的程序

1.6 拉曼光譜采集

拉曼光譜數(shù)據(jù)采集之前，用乙腈校正儀器采用785 nm激發(fā)波長。參數(shù)如下：功率為200 mW，掃描范圍200～3 300 cm-1，光學(xué)分辨率2 cm-1，積分時間10 s，采集3次取平均光譜值。將組胺粉末用載玻片壓平在石英板上，用配套顯微鏡平臺進行組胺固體采集。向2 mL石英瓶中依次加入500 μL納米增強劑、100 μL待測液、100 μL氯化鈉，放入配套液體樣品池進行SERS采集。所有數(shù)據(jù)分析基于MATAB R2014a、Gaussian.v 09、OMNIC v8.2、Origin v8.0、SPSS v17.0平臺完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 組胺的拉曼光譜

圖1 組胺的分子結(jié)構(gòu)

圖2是組胺的拉曼光譜，其中圖2中a為組胺標(biāo)準品固體的拉曼光譜，圖2中b是采用密度泛函理論計算模擬得到的組胺拉曼光譜。從圖可看出，譜峰321、376、647、811、1 032、1 099、1 376、1 432、1 477 cm-1與密度泛函理論計算譜峰319、379、648、811、1 030、1 098、1 291、1 377、1 433、1 478 cm-1基本一致。對組胺進行譜峰歸屬[14-16](表2)，其中譜峰321、376 cm-1為組胺分子中骨架表面外彎曲振動，譜峰647和811 cm-1是組胺分子表面外環(huán)振動，譜峰1 032 cm-1為組胺分子的C—H表面內(nèi)變形振動，譜峰1 099 cm-1為組胺分子的C—N伸縮振動，譜峰1 376、1 477 cm-1為組胺分子環(huán)伸縮振動，譜峰1 432 cm-1是組胺分子的環(huán)振動和N—H基團的表面內(nèi)彎曲振動共同作用。這些譜峰可作為組胺的拉曼特征峰。

圖2 (a)組胺粉末及其分子模擬(b)計算得到的拉曼光譜

2.2 不同納米增強基底對組胺標(biāo)準品分子的增強效果

圖3中a和b分別是濃度為100 mg·L-1的組胺標(biāo)準溶液銀納米基底和金納米基底SERS光譜，圖3中c和d為組胺溶液拉曼光譜和三氯乙酸溶劑的拉曼光譜圖。組胺普通拉曼光譜所獲得譜峰為溶劑三氯乙酸有效特征峰432、749、844、939、1 339 cm-1。而在SERS光譜圖中a和b獲得953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1處的組胺拉曼峰較強，這些特征峰的譜峰歸屬結(jié)果見表2。

表2 組胺分子的拉曼譜峰歸屬

通過使用TEM透射電鏡表征2種增強劑。對比圖3中a和b，銀納米粒子直徑約60 nm，金納米粒子直徑40 nm，2種納米粒子的粒徑大小都較均勻。金納米溶膠對組胺分子的拉曼信號強度更高，在953、992、1 262、1 106、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1處增強效果明顯，說明金納米基底能夠有效吸附陰性組胺分子，獲得更強信號效果，后續(xù)研究采用金納米增強基底。由于不同種類物質(zhì)的拉曼增強效應(yīng)差異較大，且不同增強基底對同一物質(zhì)的增強效應(yīng)不同[16]。在今后研究中，可進一步探討適合于組胺的納米增強基底，以提高方法的靈敏度。

對組胺標(biāo)準溶液的表面增強拉曼光譜進行平滑、基線校正等預(yù)處理，以去除噪聲和基線漂移的影響，圖4為經(jīng)預(yù)處理后不同濃度組胺標(biāo)準品SERS譜圖。從圖中可看出，隨著組胺濃度的降低，組胺分子953、992、1 030、1 106、1 186、1 262、1 317、1 425、1 593 cm-1的9處拉曼峰強度逐漸減弱，易識別；濃度為0.5 mg·L-1時，無法檢測到有效譜峰，譜圖與三氯乙酸SERS信號一致。由此表明，利用金納米溶膠增強拉曼光譜技術(shù)檢測組胺溶液的最低濃度為1 mg·L-1。

A—組胺溶液銀納米溶膠；b—組胺溶液金納米溶膠；c—組胺;d—溶劑三氯乙酸。圖3 組胺溶液的SERS光譜及組胺、三氯乙酸的拉曼光譜

a～h依次為100、75、50、25、10、5、1、0.5 mg·L-1。圖4 不同濃度組胺溶液的SERS光譜

2.3 米魚中組胺的表面增強拉曼光譜檢測結(jié)果

圖5是經(jīng)過光譜預(yù)處理后不同組胺含量的米魚肉提取液SERS譜圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，受米魚肉提取液中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的影響，獲得大量拉曼譜峰信號，扣除圖5中q米魚空白SERS光譜信號，可明顯識別5處組胺分子拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，隨著濃度降低，譜峰強信號逐漸減弱。當(dāng)濃度在1 mg·L-1時，依然可以識別。由此斷定，這5個譜峰可作為米魚肉中組胺定性定量判別的依據(jù)，利用SERS方法對米魚中的組胺最低檢測濃度為1 mg·kg-1。國際標(biāo)準規(guī)定米魚中組胺最大殘留量為100 mg·kg-1，此方法能達到定性定量分析的要求。

a～q依次為100、95、90、80、75、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、1、0 mg·L-1。圖5 經(jīng)過光譜預(yù)處理后不同濃度含量組胺的米魚肉提取液SERS曲線

由于1 262 cm-1處特征峰的峰強較高，且附近沒有疊峰和雜峰影響，選用該特征峰的峰強度建立米魚中組胺含量的定量分析模型。圖6和圖7是以1 262 cm-1處組胺SERS特征峰強度與組胺濃度制作的一元線性標(biāo)準曲線，在濃度范圍為0～100 mg·L-1時，線性方程為y=27.889x+106.25，相關(guān)系數(shù)R2=0.980 6，線性相關(guān)性良好。

圖6 米魚中不同組胺含量在1 262 cm-1特征峰處的峰強度

圖7 以1 262 cm-1處組胺SERS特征峰強度與組胺濃度擬合得到的一元線性標(biāo)準曲線

2.4 模型準確度驗證

為了驗證方法的準確度，本實驗對米魚肉中組胺真實含量進行預(yù)測，選取4 ℃下放置1、4、7 d的米魚肉各5份，共計15個樣本，分別采集SERS信號，每個樣本采集6次。并用HPLC國標(biāo)方法測定15個樣本的真實值，比較真實值與預(yù)測值。表3為米魚肉中組胺的真實值與預(yù)測值對比結(jié)果，相對標(biāo)準偏差為2.6%～4.7%，回收率為87.0%～117.3%。SERS技術(shù)的預(yù)測值與HPLC方法的測量值基本一致，表明利用表面增強拉曼光譜方法快速檢測米魚肉中組胺含量是可行的。說明所建立方法的精密度、準確度較好，可靠性較高。

表3 米魚肉中組胺含量所測得真實值與預(yù)測值

3 小結(jié)與結(jié)論

采用表面增強拉曼光譜技術(shù)和快速溶劑提取前處理方法檢測米魚中組胺含量，找到組胺的5處拉曼特征峰(953、992、1 106、1 262、1 317 cm-1)，將這些特征峰作為組胺的定性定量判別依據(jù)，對比不同納米增強劑效果，得出金納米粒子對組胺分子的增強效果更好，該方法對米魚中組胺最低檢測濃度為1 mg·L-1，在組胺1 262 cm-1特征峰峰強與組胺濃度建立線性方程，呈良好的線性相關(guān)性，方法的回收率為87.0%～117.3%，相對標(biāo)準偏差在2.6%～4.7%。

用3個放置不同天數(shù)的15個米魚肉樣本驗證預(yù)測模型的精確性，結(jié)果表明，SERS技術(shù)的預(yù)測值與HPLC方法的測量值基本一致；預(yù)測值與實際測量值之間無顯著差異，說明采用該方法檢測米魚肉中的組胺是準確可靠的。研究結(jié)果表明，SERS技術(shù)能夠?qū)γ佐~中組胺檢測提供快速、新穎、準確的研究思路。