劉 宇， 李增威， 鄧志鵬， 張慶賢*， 鄒立扣*

1. 成都理工大學(xué)， 地學(xué)核技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610059 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院， 四川 成都 611130

引 言

隨著生活水平不斷提高， 人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視， 從而暴露出各種食品污染問(wèn)題， 其中， 食源性微生物污染的問(wèn)題與人們的生活息息相關(guān)。 微生物檢測(cè)技術(shù)是保證食品安全的基礎(chǔ)技術(shù)， 其核心在于高效、 快速地檢測(cè)微生物。 我國(guó)常用的傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)主要是顯微鏡檢測(cè)法和平板培養(yǎng)法， 它在一段時(shí)間內(nèi)為我國(guó)的微生物檢測(cè)實(shí)踐提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)， 但其效率低下、 流程冗長(zhǎng)， 無(wú)法滿(mǎn)足快速發(fā)展的食品安全檢測(cè)需求， 因此相繼提出各種微生物快速檢測(cè)技術(shù)。 3M公司和RCP Scientific Inc公司提出即用紙片法， 可檢測(cè)大腸桿菌(Escherichiacoli)等常見(jiàn)菌種的計(jì)數(shù)及菌落總數(shù)， 此法大大提升了工作效率， 但實(shí)驗(yàn)成本較高。 隨著色譜和光譜檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于微生物檢測(cè)， Kim等利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)， 高效、 快速地鑒定了球芽孢桿菌(Bacillusglobigii)、 大腸桿菌(E.coli)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)[1]； 高雯瑄等研究總結(jié)了PCR技術(shù)在沙門(mén)氏菌(Salmonella)、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等六種食源性致病菌的定量檢測(cè)應(yīng)用[2]。 這些高效的檢測(cè)技術(shù)具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性， 但儀器和實(shí)驗(yàn)操作對(duì)研究者的要求較高。 從光譜化學(xué)分析的角度， Shelly等通過(guò)熒光譜鑒定了生長(zhǎng)介質(zhì)中的假單胞菌[3]； Giana等基于410和430 nm激光激發(fā)的熒光光譜分析， 研究了糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的檢測(cè)方法[4]； Arabia等利用266和405 nm激光， 獲得液相細(xì)菌光譜指紋圖譜， 識(shí)別了金黃色葡萄球菌(S.aureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[5]； Bhatta等通過(guò)乳桿菌(Lactobacillus)、 酵母菌(Saccharomyces)的熒光光譜研究了它們的特性[6]。 這些研究顯示了激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence spectrometry， LIFS)應(yīng)用在細(xì)菌菌株識(shí)別和定量技術(shù)的潛力， LIFS是一種快速、 簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)有效的快速識(shí)別細(xì)菌方法。

論文提出利用熒光光譜特征對(duì)不同的細(xì)菌樣品進(jìn)行快速識(shí)別和表征， 以405 nm激光作為激發(fā)光源， 搭建了一套激光誘導(dǎo)熒光光譜的檢測(cè)系統(tǒng)， 以三種常見(jiàn)致病細(xì)菌為樣本(一種革蘭陽(yáng)性菌糞腸球菌(E.faecalis)， 兩種革蘭陰性菌包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S. Typhimurium)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))， 對(duì)三種細(xì)菌的菌液樣本進(jìn)行熒光激發(fā)， 分析了三種細(xì)菌樣本的熒光光譜特性差異。 對(duì)糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光光譜分段處理， 提取9個(gè)特征量， 用于動(dòng)態(tài)聚類(lèi)算法(dynamic clustering algorithm,DC)識(shí)別， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 測(cè)量原理

根據(jù)分子熒光效應(yīng)和光譜分析原理[7]， 當(dāng)光致分子受到紫外光照射， 熒光基團(tuán)吸收能量， 輻射出頻率更低的熒光， 每種物質(zhì)因其獨(dú)一無(wú)二的結(jié)構(gòu)， 熒光效應(yīng)都有其特定吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)， 表現(xiàn)出不同的熒光光譜特性。

細(xì)菌中含有各種具有固有熒光基團(tuán)的生物分子[8]， 由于熒光基團(tuán)含量、 細(xì)菌結(jié)構(gòu)或者理化成分存在差異， 不同細(xì)菌在激光誘導(dǎo)下產(chǎn)生的熒光光譜有所差別， 可根據(jù)熒光特性進(jìn)行細(xì)菌的分類(lèi)識(shí)別。

1.2 系統(tǒng)與參數(shù)

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由405 nm激光模塊、 熒光探頭模塊、 熒光光譜采集模塊、 控制模塊、 控制和能譜處理軟件模塊組成[9]， 如圖1所示。

圖1 便捷式405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of portable 405 nm laser-inducedfluorescence detector

工作時(shí)， 激光器光源發(fā)射出405 nm激光， 經(jīng)熒光探頭用聚焦透鏡將激發(fā)光聚焦到待激發(fā)樣品， 激光能量激發(fā)熒光分子， 進(jìn)而發(fā)生能級(jí)躍遷并發(fā)出熒光， 利用同一聚焦透鏡同時(shí)收集熒光。 探頭內(nèi)置405 nm濾光片組， 將反射回來(lái)的激發(fā)光濾除并保留熒光信號(hào)， 由光譜儀采集熒光信號(hào)并由軟件進(jìn)行處理。 其中， 激光器與光譜儀的參數(shù)列在表1、 表2。

表1 激光器參數(shù)Table 1 Parameters of the laser

表2 光譜儀性能參數(shù)Table 2 Parameters of the spectrometer

1.3 試劑耗材

實(shí)驗(yàn)材料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(四川， 成都)提供， 包括細(xì)菌菌株(糞腸球菌、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌、 銅綠假單胞菌)， TSA培養(yǎng)基， TSB培養(yǎng)基， 氯化鈉(分析純)， 50 mL離心管， 超純水等。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

用接種環(huán)將甘油管中的菌株在TSA平板上劃線(xiàn)， 37 ℃下培養(yǎng)20 h； 用接種環(huán)挑取TSA平板上的單菌落接種到50 mL TSB培養(yǎng)基中， 37 ℃振蕩培養(yǎng)20 h； 培養(yǎng)完成后將菌液3 000 r·min-1離心10 min， 倒去培養(yǎng)基。 用30 mL 0.9%生理鹽水洗滌細(xì)菌， 離心倒去生理鹽水， 重復(fù)三次， 以充分洗去TSB培養(yǎng)基的殘留。 最后用0.9%生理鹽水制成細(xì)菌懸液， 并在600 nm處調(diào)節(jié)菌液濃度為1.5OD。 為了避免雜菌污染， 整個(gè)過(guò)程在超凈工作臺(tái)完成。

1.5 測(cè)定

將裝有細(xì)菌懸液的試管充分震蕩后， 用移液槍在試管中部吸取3 mL菌液轉(zhuǎn)移到石英比色皿(容量為4 mL)， 蓋上比色皿蓋子防止細(xì)菌污染儀器。 為了避免其他光源的影響， 將比色皿的光面垂直激光發(fā)射方向放置到暗室， 利用405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)菌液樣本進(jìn)行熒光激發(fā)與采集， 如圖2所示。

圖2 儀器與操作流程圖Fig.2 The instrument and operation flow chart

2 結(jié)果與討論

2.1 激光器功率驗(yàn)證

在單位時(shí)間內(nèi)， 激光器功率越高， 代表的激光器輸出能量越高， 對(duì)一些深色物質(zhì)容易因?yàn)槟芰刻叨弧盁埂保?而一些弱熒光信號(hào)的物質(zhì)需要更高的功率激發(fā)熒光信號(hào)[7]， 設(shè)置合適的激光器功率對(duì)采集的熒光信號(hào)至關(guān)重要。 選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液樣本驗(yàn)證分析熒光光譜強(qiáng)度(Intensity)與激光器功率(Power)的關(guān)系。 根據(jù)圖3(b)發(fā)現(xiàn)， 隨著激光器功率上升， 細(xì)菌的熒光強(qiáng)度隨之上升。 在功率10～100 mW范圍內(nèi)， 細(xì)菌樣本的熒光強(qiáng)度與激光器功率呈良好的線(xiàn)性關(guān)系， 擬合優(yōu)度R2=0.997。

圖3 P=10～100 mW， c=1.5OD， 糞腸球菌的熒光譜圖(a)； 熒光強(qiáng)度與功率的線(xiàn)性關(guān)系圖(b)Fig.3 P=10～100 mW， c=1.5OD， the fluorescence spectra of E.faecalis (a); and Relationship between Intensity and Power (b)

為了避免功率過(guò)低光譜噪聲大、 功率過(guò)高引起“燒灼”， 影響細(xì)菌的熒光效果， 建議選用50～80 mW的激光器功率， 本實(shí)驗(yàn)采用50 mW。

2.2 光譜分析

在P=50 mW，λ=405 nm激光下誘導(dǎo)熒光， 光譜儀將采集到的熒光光譜進(jìn)行平滑和峰值歸一化處理， 光譜范圍設(shè)置為400～800 nm， 得到如圖4所示的熒光光譜圖， 細(xì)菌樣本的峰值特征在表3列出。

圖4 細(xì)菌樣本的熒光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of bacteria samples

表3 P=50 mW， λ=405 nm時(shí)， 細(xì)菌樣本的 峰值波長(zhǎng)和相對(duì)強(qiáng)度Table 3 P=50 mW,λ=405 nm, peak wavelengthand relative intensity of bacteria samples

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 鼠傷寒沙門(mén)氏菌、 糞腸球菌和銅綠假單胞菌顯示出獨(dú)特的熒光光譜。 細(xì)菌具有的熒光基團(tuán)大致相同， 主要由卟啉(Porphyrin)、 輔酶(Coenzyme)、 NADH(NADPH)和黃素(Flavins)等組成[8]， 但熒光基團(tuán)含量、 細(xì)菌生物體結(jié)構(gòu)以及不同細(xì)菌吸收激光能量的程度都存在差異， 形成了獨(dú)特的細(xì)菌熒光譜圖。 同為革蘭陰性菌， 鼠傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌發(fā)射出的熒光在515 nm附近， 此外， 銅綠假單胞菌的熒光光譜還分別在634和703 nm顯示出熒光峰， 且634 nm處熒光峰峰值對(duì)應(yīng)光譜峰值最大值， 而革蘭陽(yáng)性菌糞腸球菌的光譜在530 nm才出現(xiàn)熒光峰。 資料表明革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚(約20～80 nm)， 肽聚糖是其主要成分， 而革蘭陰性菌細(xì)胞較薄(約10 nm)， 除了肽聚糖， 還包含其他復(fù)雜成分， 如脂多糖、 脂蛋白等[10]。 前人的研究表明不同熒光基團(tuán)對(duì)應(yīng)特定的熒光峰， 如表4所示。 溶劑生理鹽水(NS)的熒光峰出現(xiàn)在λ=467 nm， 對(duì)應(yīng)—OH熒光基團(tuán)[11]； Koenig等研究指出， 黃酮類(lèi)發(fā)出綠色熒光(530 nm)[8]， 由此認(rèn)為糞腸球菌在528 nm附近的熒光峰可能對(duì)應(yīng)著黃酮類(lèi)基團(tuán)的熒光發(fā)射， 而銅綠假單胞菌在634 nm的熒光峰則可能對(duì)應(yīng)著原卟啉基團(tuán)的熒光響應(yīng)(633 nm)。

表4 具有較高熒光量子效率的熒光基團(tuán)及其最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)[12]

2.3 細(xì)菌識(shí)別

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 利用P=50 mW，λ=405 nm的激光， 誘導(dǎo)出銅綠假單胞菌的熒光峰， 分別在634和707 nm處產(chǎn)生異于其他兩種細(xì)菌的熒光峰， 顯示出較強(qiáng)的獨(dú)特性， 根據(jù)該熒光特性， 可以直接實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的特異性識(shí)別。 糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光光譜圖除本底熒光峰， 僅包含一個(gè)較寬的熒光峰， 峰位也大致相同， 無(wú)法直接進(jìn)行識(shí)別， 但細(xì)菌熒光峰與溶劑熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度比和熒光峰上升、 下降的梯度都存在區(qū)別， 考慮兩種差異， 論文基于多元分析方法， 提出LIFS結(jié)合動(dòng)態(tài)聚類(lèi)的方法識(shí)別細(xì)菌種類(lèi)， 具體實(shí)驗(yàn)操作步驟為： 分別配置濃度為1.5OD的糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌液樣本各60組， 在P=50 mW，λ=405 nm激光條件下進(jìn)行激發(fā)熒光， 獲得熒光光譜120組； 如圖5所示， 對(duì)459～586 nm之間光譜劃分為9個(gè)特征區(qū)域， 以a1(溶劑的熒光峰)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到9個(gè)特征量(Characteristic value)， 由此得到120組包含9個(gè)特征量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(聚點(diǎn)， Point)， 見(jiàn)表5， 隨機(jī)將120組聚點(diǎn)按照7∶3的比例分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。

圖5 劃分特征區(qū)域Fig.5 Division of characteristic areas

表5 特征區(qū)域和特征量Table 5 Characteristic areas and values

實(shí)驗(yàn)中， 在訓(xùn)練集中隨機(jī)選取兩組聚點(diǎn)作為初始聚點(diǎn)； 分別計(jì)算其他聚點(diǎn)與初始標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)的歐氏距離[式(1)]； 按照最短距離原則， 將距離最近的聚點(diǎn)與初始標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)合并(對(duì)特征量求平均值)作為二代標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)； 重復(fù)如上步驟， 直到進(jìn)行完全聚類(lèi)， 得到最終的標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)[圖6(a)]。 將測(cè)試集的樣本聚點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)按照最短距離進(jìn)行聚類(lèi)判斷[圖6(b)]， 實(shí)現(xiàn)對(duì)未知細(xì)菌的識(shí)別， 得到識(shí)別結(jié)果(表6)。

表6 動(dòng)態(tài)聚類(lèi)對(duì)糞腸球菌、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌的識(shí)別率Table 6 Correct recognition rate of E.faecalisand S. Typhimurium by DC

圖6 訓(xùn)練集標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)(a)、 測(cè)試集樣本聚點(diǎn)(b)Fig.6 The standard cluster point of training set (a),sample cluster points of test set (b)

式(1)中， xk為標(biāo)準(zhǔn)聚點(diǎn)的特征量的值， k=1∶9； yk為測(cè)試集的特征量的值。

對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的識(shí)別率皆為100%， 無(wú)識(shí)別錯(cuò)誤和未識(shí)別數(shù)據(jù)， 說(shuō)明LIFS結(jié)合動(dòng)態(tài)聚類(lèi)分析對(duì)三種常見(jiàn)食源性致病菌快速檢測(cè)的可行性。 本研究方法檢測(cè)費(fèi)用較低， 無(wú)需大量的生化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及耗材[1-2]， 儀器成本較低； 識(shí)別速度快， 銅綠假單胞菌實(shí)現(xiàn)了即時(shí)識(shí)別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌數(shù)據(jù)處理耗時(shí)10 min左右， 優(yōu)于FCM法(約3 d)[1]、 PCR反應(yīng)體系(2 d)[2]等； 同時(shí)， 三種細(xì)菌都實(shí)現(xiàn)了100%識(shí)別， 該法識(shí)別率高。

利用便捷式405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種常見(jiàn)食源性致病菌的無(wú)接觸檢測(cè)， 檢測(cè)速度快， 識(shí)別效率高， 但目前所做的工作僅限于對(duì)樣品熒光光譜特征進(jìn)行研究， 沒(méi)有討論微生物在培養(yǎng)、 制樣及照射過(guò)程中涉及的生物化學(xué)變化等， 這些將值得更深入的分析討論。

3 結(jié) 論

利用便捷式405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)， 對(duì)糞腸球菌、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌、 銅綠假單胞菌等常見(jiàn)食品污染致病菌誘導(dǎo)熒光， 發(fā)現(xiàn)三種細(xì)菌的熒光光譜各有差異。 簡(jiǎn)單驗(yàn)證了激光器功率與細(xì)菌熒光強(qiáng)度的關(guān)系， 得出最佳激光器功率范圍為50～80 mW。 在P=50 mW，λ=405 nm激光誘導(dǎo)下， 銅綠假單胞菌的熒光光譜在λ=634 nm和λ=703 nm產(chǎn)生有別于其他兩種細(xì)菌的熒光峰， 可以據(jù)此對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行直接識(shí)別。 基于動(dòng)態(tài)聚類(lèi)的思想， 采集糞腸球菌， 鼠傷寒沙門(mén)氏菌120組熒光數(shù)據(jù)并隨機(jī)分為訓(xùn)練集84組、 測(cè)試集36組， 對(duì)熒光譜圖劃分9個(gè)特征區(qū)域進(jìn)行特征量聚類(lèi)識(shí)別， 得出糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的識(shí)別率為100%， 實(shí)現(xiàn)對(duì)糞腸球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的快速識(shí)別。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證， 激光誘導(dǎo)熒光光譜法操作簡(jiǎn)單， 檢測(cè)速度快， 效率高， 結(jié)合動(dòng)態(tài)聚類(lèi)的思想， 為實(shí)際微生物快速檢測(cè)討論設(shè)計(jì)了一種新的測(cè)試方法。