◎ 陶 燕，康雪梅，李 超，趙雪峰，曹靜杰，賈松濤，李夢雨，趙林萍

（河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001）

黃曲霉毒素（AFs）是自然界中黃曲霉和寄生曲霉屬真菌產(chǎn)生的有毒代謝物。有一系列不同類型的AFs，AFB1和AFG1（黃曲霉毒素G1）毒性最強(qiáng)，食用受污染的谷物或動(dòng)物產(chǎn)品可能影響人體健康。據(jù)報(bào)道，AFB1具有致癌作用，是一種免疫抑制劑，即對人體有致癌作用。因此，迫切需要一種高選擇性的AFB1檢測方法。

黃曲霉毒素分析方法有很多，有研究[1]對樣品預(yù)處理和分析方法進(jìn)行了分類，免疫親和或多純化柱是儀器分析常用的材料，如高效液相色譜、氣相色譜和液相色譜。這些方法要求實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善，耗時(shí)且昂貴。AFB1的檢測方法和商業(yè)試劑盒有很多，免疫化學(xué)方法已成功用于食品和飼料中AFB1的檢測。YU等[2]發(fā)現(xiàn)AFB1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的檢測限 （LOD）為10 pg·mL-1和90 pg·mL-1。ELISA可 能出現(xiàn)假陽性或陰性，常有基質(zhì)干擾，且檢測時(shí)間很長。近年來，納米材料已廣泛應(yīng)用于免疫分析的開發(fā)。納米顆粒已被用作固定化生物分子的支撐材料或作為示蹤劑獲得擴(kuò)增檢測。磁性微球具有良好的生物相容性，反應(yīng)后易于從反應(yīng)溶液中分離。目前，已經(jīng)開發(fā)出利用金納米顆粒對AFB1進(jìn)行磁性比色免疫分析，WANG等[3]描述了一種檢測AFB1的競爭性方法，在樣品中的AFB1和涂上AFB1-BSA的磁性微球間進(jìn)行競爭性結(jié)合，該方法已應(yīng)用于玉米樣品檢測。但上述描述的方法都由許多組件和步驟組成，成本較高，且準(zhǔn)備工作較長，當(dāng)在分析中使用多組件時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不正確結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，因此，急需一種快速、簡單的AFB1測定方法。

本文提出了一種快速、靈敏的基于MNP的AFB1免疫熒光檢測方法，該方法僅由兩種成分組成，即涂有MNPs的多克隆抗AFB1抗體和AFB1-BSA-FITC熒光偶聯(lián)物。該方法滿足了用戶的3個(gè)主要要求：樣本量小、AFB1檢出限低、檢測時(shí)間短。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物、熒光素5（6）-異硫氰酸酯、二甲基甲酰胺、Sephadex G25培養(yǎng)基、2-氨基-2-（羥甲基）-1,3-丙二醇（Tris）、NaCl、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）、兔分離抗血清產(chǎn)生的多克隆抗黃曲霉毒素B1抗體、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫80，均從德國Sigma Aldrich訂購。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)ELGA PURELAB Option純化。

1.2 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

AFB1-BSA的熒光偶聯(lián)物的獲得。熒光素5（6）-異硫氰酸酯（FITC）為熒光標(biāo)記物，最大發(fā)射波長519 nm（綠色）。偶聯(lián)方法是，1.5 mg AFB1-BSA加入到1 mL碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH=9.6），F(xiàn)ITC溶于二甲基甲酰胺（1 mg·mL-1），然后，AFB1-BSA與0.24 mL FITC溶液混合在一個(gè)避光的玻璃瓶中。在4 ℃下反應(yīng)過夜后，用Sephadex G25中性柱子（10×220 mm）過濾反應(yīng)混合物，用Tris緩沖液（pH=8.2）洗脫。使用6900紫外/可見分光光度計(jì)測定各組分的吸光度，265 nm（AFB1）、280 nm（蛋白質(zhì)）和495 nm（FITC），通過熒光分光光度分析（Perkin Elmer LS45熒光分光光度計(jì)）證實(shí)了所得到的熒光共軛物為AFB1-BSA-FITC。

1.3 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

磁性納米顆粒（MNPs）參照GABROVSKA等人[4]研究的制備方法獲得。利用APTES修飾，使其在MNPs上形成氨基基團(tuán)[5]。①經(jīng)修飾的MNPs作為多克隆抗-AFB1抗體的固相載體，戊二醛活化納米粒子用于抗體結(jié)合，APTES涂層的MNPs（10 mg）懸浮于2 mL 5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（PB，50 mmol · L-1， pH為8.0），室溫下在搖床上反應(yīng)2 h，將活化的涂布APTES的MNPs用2 mL 50 mmol·L-1PB洗滌（pH 8.0），再用2 mL 10 mmol·L-1PB（pH 7.4）洗滌5次。 ②完全去除多余的戊二醛后，將多克隆抗-AFB1抗體（327 μg·mL-1）1.6 mL 10 mmol·L-1PB（pH 7.4）加入到納米粒子中。懸浮液在4 ℃下反應(yīng)過夜。抗-AFB1抗體被固定在活化的APTES涂層MNPs上（MNP-Ab），用10 mmol·L-1pH為7.4的PB進(jìn)行3次洗滌，加入 2 mL阻斷液（10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含5% BSA和0.05% Tween 80），在室溫下?lián)u床上反應(yīng)1 h；然后對MNP-Ab進(jìn)行4次洗滌。③將MNP-Ab重新懸浮于10 mmol·L-1PB（pH=7.4）至終濃度為5 mg·mL-1。

檢測固定化抗體活性。在聚苯乙烯微效板上對抗-AFB1抗體進(jìn)行非特異性吸附，采用Bradford法 （100 μg）測定抗體吸附量。使用和MNP-Ab相同數(shù)量的抗體，3種濃度的AFB1-BSA-FITC熒光共軛物（30 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1，10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含10%甲醇）用于抗體活性測定。

1.4 MNP-Ab用量和熒光共軛濃度的優(yōu)化

優(yōu)化MNP-Ab的用量和AFB1-BSA-FITC的濃度。比較3種不同用量的MNP-Ab：0.125 mg、0.250 mg和0.375 mg，稀釋緩沖液為10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含10%甲醇。①幾種不同濃度的200 μL AFB1樣 品（0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、 50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1）加入含MNP-Ab小瓶中，在37 ℃搖床中反應(yīng)15 min。②每個(gè)樣品中加入熒光偶聯(lián)物AFB1-BSA-FITC 22 μL（28 μg·mL-1），這些混合物在37 ℃搖床進(jìn)一步反應(yīng)15 min。③用磁力分離器收集偶聯(lián)AFB1的MNP-Ab和偶聯(lián)AFB1-BSA-FITC的MNP-Ab。測定上清液中過量的AFB1-BSA-FITC熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與AFB1與MNP-Ab結(jié)合呈線性正相關(guān)，熒光測量采用熒光分光光度計(jì)，得到的熒光數(shù)據(jù)歸一化（NS，%），采用公式（1）計(jì)算：

式中：B0為初始AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物溶液的熒光強(qiáng)度，b為含AFB1樣品的熒光強(qiáng)度，Bx為不含AFB1樣品的熒光強(qiáng)度。

歸一化信號與樣本中AFB1濃度呈線性負(fù)相關(guān)，NS越高，AFB1濃度越低。

優(yōu)化AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)濃度。試驗(yàn)偶聯(lián)物濃 度 分 別 為22 μg·mL-1、28 μg·mL-1和35 μg·mL-1， AFB1的使用濃度分別為0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1。①在小瓶中加入0.25 mg MNP-Ab。②加入200 μL AFB1溶液，在37 ℃搖床中反應(yīng)15 min。③加入22 μL的偶聯(lián)物，在相同條件下反應(yīng)。④使用磁力分離器收集上清液中的過量的AFB1-BSA-FITC，按上述方法測定上清液的熒光強(qiáng)度，并將信號歸一化。

1.5 花生中AFB1的測定

花生用研缽和杵磨成細(xì)粉，過篩。將所得的花生粉放入4個(gè)容器中（各1 g），3個(gè)樣品，1種沒有毒素只有甲醇的樣品。加入溶于甲醇的AFB1使之達(dá)到 3個(gè)AFB1濃度水平（0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1）。 樣品分別在室溫下干燥過夜提取。提取時(shí)甲醇/水的比例為80/20（5 mL）。進(jìn)行下一步含量檢測。①制備4瓶MNP-Ab（0.25 mg）。②加 入200 μL的 花生AFB1稀釋提取物，懸濁液在搖床中37 ℃下反應(yīng) 15 min。③加 入AFB1-BSA-FITC偶 聯(lián) 物22 μL，濃度為28 μg·mL-1（稀釋緩沖液為含有0.1% BSA的 PB-10%甲醇），在37 ℃的搖床中反應(yīng)15 min后，按上述方法測定上清液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

競爭性抗原-熒光染料的制備是競爭性免疫熒光分析的主要內(nèi)容之一。在本研究中，使用商業(yè)上可獲得的AFB1-BSA偶聯(lián)物，可用于直接標(biāo)記FITC。

所得AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物經(jīng)紫外可見光譜和熒光分光光度分析可證實(shí)。比較AFB1-BSA-FITC、游離的AFB1-BSA和游離的FITC的吸收光譜，該熒光偶聯(lián)物對游離的AFB1-BSA的典型吸收最大值為265 nm和355 nm，對游離的FITC的吸收最大值為495 nm，這3個(gè)峰的存在是AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)形成的證據(jù)。在光譜中AFB1（自身熒光）在435 nm的特征發(fā)射峰可以觀察到，在527 nm處還出現(xiàn)了另一個(gè)峰，這是FITC在偶聯(lián)物中存在的證據(jù)。因此，AFB1-BSAFITC偶聯(lián)物被成功制備。

2.2 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

通過濕法合成的MNPs中含有羥基作為官能團(tuán)，固定抗體較為困難，因此修飾MNPs是一個(gè)必要的步驟。通過APTES涂層在MNPs表面獲得了氨基，經(jīng)過APTES改性后，顆粒尺寸增大，涂覆后MNPs尺寸為8.2 nm，這種MNPs尺寸對于確保磁體完全分離是非常重要的。

APTES包被的MNPs作為多克隆抗AFB1抗體固定化的固體載體。通過戊二醛結(jié)合劑將APTES包覆的MNP表面上的氨基與抗體氨基偶聯(lián)，偶聯(lián)后進(jìn)行Bradford檢測，結(jié)果表明，每1 mg MNPs固定有40 μg抗-AFB1抗體。測定了固定在MNPs的抗體的活性，并與吸附在微孔板上的游離抗體的活性進(jìn)行了比較，比較結(jié)果表明，兩種抗體的活性非常相似，相對活性為92%，結(jié)果表明，固定在MNPs上的抗AFB1抗體活性不受化學(xué)結(jié)合劑的影響。

2.3 MNP-Ab用量的優(yōu)化

MNP-Ab含量和熒光偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化是建立單一免疫分析法的重要步驟。不同濃度的MNP-Ab分別在AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物（28 μg·mL-1）和5種不同濃度的目標(biāo)抗原（AFB1）下使用。圖1顯示了從5種 不 同 濃 度 的AFB1（0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、 12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1） 和 3種不同數(shù)量的MNP-Ab中獲得的歸一化信號，歸一化信號與樣品中的AFB1濃度呈線性負(fù)相關(guān)。

圖1 MNP-Ab的用量優(yōu)化圖

結(jié)果表明，MNP-Ab的最佳用量為0.250 mg。這種情況下，上清液中游離的偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度足夠高，不同AFB1添加濃度下上清液中熒光強(qiáng)度的變化也是最大的。顯然，此濃度抗體提供的免疫分析分辨率較好。

2.4 熒光共軛物的優(yōu)化濃度

對熒光共軛物的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。主要目標(biāo)在不同的抗原濃度下獲得足夠強(qiáng)的熒光信號和良好的分辨率。在不同AFB1濃度下（0.25 pg·mL-1、 1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和 100.00 pg·mL-1），AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)熒光信號變化最大時(shí)，濃度為28 μg·mL-1，信號歸一化后可得到證實(shí)。因此，此共軛濃度被選擇為最佳，以確保提高免疫分析分辨率。

圖2 優(yōu)化的AFB1-BSA-FITC濃度隨AFB1濃度變化圖

2.5 花生中AFB1的測定

花生中加入溶于甲醇的AFB1以達(dá)到3種不同濃度（0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1），同 時(shí) 選 一 個(gè)不含毒素只有甲醇的花生樣本，樣品干燥后，進(jìn)行提取程序，提取后稀釋提取液，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和回收率，見表1，花生中AFB1濃度越低，其結(jié)果RSD越低，可接受的回收率為96%～120%。樣品體積為40 μL，不提取情況下，檢測時(shí)間不超過 35 min，同時(shí)獲得的LOD足夠低（0.9 pg·mL-1），因此，建立的免疫分析法可用于實(shí)際樣品中AFB1的檢測。所開發(fā)的檢測方法能夠在沒有非特異性干擾的情況下測定低濃度的毒素。

表1 添加花生樣品中AFB1的檢測結(jié)果及回收率表（n=3）

3 結(jié)論

建立了一種快速、靈敏的基于MNP的競爭性免疫熒光檢測方法檢測AFB1，檢測線性范圍為2～100 pg·mL-1， AFB1免疫檢測的LOD較低，為0.9 pg·mL-1。獲得的免疫測定時(shí)間小于35 min。在這種體系中，分析物到固定抗體的傳質(zhì)距離大大縮短，因此，與抗體固定在平面表面（如酶標(biāo)板孔）相比，可更快實(shí)現(xiàn)抗體-抗原結(jié)合平衡。所得結(jié)果證實(shí)了所開發(fā)的基于磁性納米顆粒的免疫熒光法在實(shí)際樣品中測定AFB1的優(yōu)勢。