周慧芬，李 勇，孔維浩，趙辛元

(1.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市衛(wèi)生服務(wù)中心；3.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

高血壓是臨床常見(jiàn)的慢性病，是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重危害人民的健康。長(zhǎng)期的壓力負(fù)荷可通過(guò)心臟、血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，引起左心室心肌重塑和心室纖維化，包括心肌細(xì)胞肥大、凋亡和胚胎基因、蛋白質(zhì)的再表達(dá)[1]。其中，心室重塑是指心室?guī)缀?、質(zhì)量、體積和功能的變化，以適應(yīng)心肌損傷或負(fù)荷的變化，病理性心室重塑程度是預(yù)測(cè)心臟病預(yù)后的有力證據(jù)[2]；心肌纖維化是指心肌間質(zhì)膠原濃度升高及膠原特性構(gòu)型改變[3]，它是高血壓后期心肌重塑的關(guān)鍵病理特征之一，也作為高血壓病程中出現(xiàn)心肌缺血、心律失常甚至心源性猝死的重要原因[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)可減少心血管疾病(CVD)事件[5]。ARB替米沙坦通過(guò)血管緊張素Ⅱ AT1受體阻滯和過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體γ(PPARγ)激活來(lái)減輕炎癥[6]，而炎癥是高血壓進(jìn)程中心肌纖維化重要表現(xiàn)。本研究通過(guò)建立高血壓的大鼠模型，探討替米沙坦治療對(duì)心肌纖維化的抑制作用及可能機(jī)制，為臨床早期干預(yù)并治療心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

12周齡雄性SD大鼠28只，體重(220±20)g，由武漢大學(xué)ABSL-3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠(4只/籠)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房(23℃)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，以及規(guī)律光照(晝夜各12h)。替米沙坦試劑購(gòu)于上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司(80mg)。MMP-1、TIMP-1單克隆抗體，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ單克隆抗體，SP試劑盒，DAB顯色試劑購(gòu)于武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 高血壓模型的建立及分組

大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=7)、假手術(shù)組(n=7)及模型組(n=14)。模型組采取二腎一夾法[5]建立高血壓大鼠模型，建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、替米沙坦治療組(以下簡(jiǎn)稱治療組)，每組各7只。治療組給予替米沙坦(30mg/kg)灌胃，其它3組給予同體積的生理鹽水灌胃，1次/d，每周測(cè)量一次血壓，連續(xù)8周。

1.2.2 組織稱重并取材

禁食12h，每只動(dòng)物稱取體重(BW)后，乙醚麻醉，解剖后迅速取出心臟，稱心臟(HW)和左心室(含室間隔)重量(LVW)，心臟體重指數(shù)為HW/BW(mg/g)，左心室體重指數(shù)為L(zhǎng)VW/BW(mg/g)；取適當(dāng)大小的左室心肌組織迅速投入10%甲醛固定。

1.2.3 心肌組織染色并觀察

取10%甲醛固定好的左室游離壁處心肌組織常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的變化。使用免疫組織化學(xué)SP法染色[5]，檢測(cè)心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的表達(dá)，用已知的陽(yáng)性切片同一條件下染色作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照顯微鏡觀察，胞漿呈棕黃色顆粒表明免疫組化陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，Olympus BX50顯微鏡攝像系統(tǒng)攝像，采用高清晰彩色圖文報(bào)告分析系統(tǒng)分析，以5個(gè)視野的光密度(OD)的平均值作為各標(biāo)本的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 替米沙坦對(duì)高血壓大鼠血壓、HW/BW、LVW/BW的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，假手術(shù)組血壓值、HW/BW、LVW/BW變化不明顯(P>0.05)，其它兩組數(shù)據(jù)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組的血壓、HW/BW、LVW/BW則明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠收縮壓、HW/BW、LVW/BW的改變

2.2 替米沙坦對(duì)大鼠心肌心肌纖維化的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：心肌組織通過(guò)HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察(圖1，封二)，空白對(duì)照組或假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯間質(zhì)纖維增生，而模型組、治療組心肌組織結(jié)構(gòu)較凌亂，間質(zhì)纖維增生明顯，但治療組心肌間質(zhì)纖維增生較模型組顯著減輕。

2.3 替米沙坦對(duì)大鼠心肌組織Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)心肌組織Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達(dá)的檢測(cè)(圖2，封二)，在光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組、假手術(shù)組心肌組織的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原陽(yáng)性表達(dá)不明顯，而模型組的陽(yáng)性表達(dá)顯著，但經(jīng)替米沙坦治療后其表達(dá)又明顯減弱；通過(guò)OD值比較(表2)，模型組、治療組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)的OD值明顯高于空白對(duì)照組或假手術(shù)組(P<0.05)，而治療組又顯著低于模型組(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-1及TIMP-1的OD值

2.4 替米沙坦對(duì)大鼠心肌組織MMP-1及TIMP-1表達(dá)的影響

結(jié)果顯示：通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)心肌組織MMP-1及TIMP-1表達(dá)的檢測(cè)(圖3，封二)，在光學(xué)顯微鏡下觀察，模型組心肌組織的MMP-1的陽(yáng)性表達(dá)明顯弱于空白對(duì)照組或假手術(shù)組，而治療組的陽(yáng)性表達(dá)較其他組明顯增強(qiáng)；模型組心肌組織的TIMP-1的陽(yáng)性表達(dá)明顯強(qiáng)于空白對(duì)照組或假手術(shù)組，而治療組的陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯減弱。

通過(guò)OD值比較(表2)，模型組心肌組織MMP-1表達(dá)的OD值明顯低于空白對(duì)照組或假手術(shù)組(P<0.05)，治療組則明顯高于其他組(P<0.05)；模型組心肌組織TIMP-1表達(dá)的OD值明顯高于空白對(duì)照組或假手術(shù)組，而治療組則明顯低于模型組(P<0.05)。

3 討 論

本研究通過(guò)結(jié)扎腎動(dòng)脈造成腎動(dòng)脈狹窄，以建立高血壓大鼠模型，術(shù)后2周收縮壓開(kāi)始上升，4周穩(wěn)定，參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[7]，當(dāng)收縮壓持續(xù)超過(guò)160mmHg，且上升值大于30mmHg時(shí)，模型建立成功。

據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，作為高血壓并發(fā)癥嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)，左心室肥厚(LVH)是老年高血壓患者心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的HW/BW、LVW/BW均明顯高于空白對(duì)照組或假手術(shù)組，提示高血壓引起大鼠左室明顯肥厚。另有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，隨著高血壓LVH程度的進(jìn)行性加重，心肌間質(zhì)膠原纖維蛋白顯著增多。膠原蛋白為心肌間質(zhì)基質(zhì)的主要成分，由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成，其中80%以上為Ⅰ型，Ⅲ型僅占11%左右，此外還有少量Ⅳ型及V型膠原等[10-11]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)較凌亂，有明顯的局部纖維化，而且其Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組及假手術(shù)組，提示高血壓引起了心肌纖維化。此外，心肌纖維化是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵，近年研究發(fā)現(xiàn)[12]，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在心肌組織中的大量表達(dá)，能特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，同時(shí)組織抑制劑(TIMPs)及一些細(xì)胞因子調(diào)控MMPs的產(chǎn)生，所以MMPs/TIMPs的比例失調(diào)是導(dǎo)致心肌纖維化的重要因素。本研究同樣顯示，模型組相對(duì)于空白對(duì)照組或假手術(shù)組，其心肌組織的MMP-1表達(dá)上升，而TIMP-1表達(dá)則顯著下降(P均<0.05)，說(shuō)明它們?cè)诟哐獕阂鸬男募±w維化過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

替米沙坦是非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，通過(guò)阻滯特異性血管緊張素受體，干擾RAAS的活性，降低人體血壓[13]，目前已有文章[14]報(bào)道，血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)能有效降低血壓，作為一種新型的降血壓藥物用于輕到中度的高血壓治療[15]，但對(duì)于ARB逆轉(zhuǎn)高血壓心臟重構(gòu)，減少或防止MF的發(fā)生，尚存較多問(wèn)題：①心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制目前還未完全闡明，故缺乏特異的治療藥物針對(duì)心肌纖維化；②國(guó)外有報(bào)道在高血壓早期就發(fā)現(xiàn)有心肌纖維化的組織學(xué)證據(jù)[16]，故早期干預(yù)心肌纖維化具有重大意義，但是否能讓患者受益更多還需要進(jìn)一步的研究；③現(xiàn)今大部分的藥物研究還停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小樣本臨床試驗(yàn)的階段，仍需要大規(guī)模多中心臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。在研究中，替米沙坦治療組相對(duì)于模型組，其收縮壓、HW/BW及LVW/BW顯著降低，心肌間質(zhì)Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)水平明顯下調(diào)，且心肌組織MMP-1水平升高而TIMP-1水平降低，說(shuō)明替米沙坦可能通過(guò)MMPs/TIMPs機(jī)制抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的生成，從而減輕心肌間質(zhì)纖維化及左心室肥厚。本研究結(jié)果可以為臨床早期干預(yù)或治療高血壓性心肌纖維化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。