宮丹丹，隋春興，石 晨，李 月，姜曉東

(1.大連市中心醫(yī)院 心內(nèi)三科， 遼寧 大連 116033； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116027)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管疾病死亡的主要原因[1]，冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)(再灌注)和早期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治療心肌梗死最有效的方法[2]。但是，心肌血流再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷甚至死亡，主要機(jī)制是心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和局部炎性反應(yīng)增加，這種現(xiàn)象被稱為“缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷”。研究表明，miR-195能夠針對(duì)性抑制血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，抑制VEGFA水平可以顯著促進(jìn)缺血區(qū)域的血管生成[3]。目前miR-26a對(duì)I/R所致心肌細(xì)胞凋亡的影響還未見報(bào)道。本研究探討miR-26a基因沉默對(duì)I/R心肌功能、心肌細(xì)胞凋亡和梗死面積的影響及對(duì)Rho/RhoA信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，10～12周齡，質(zhì)量260 g左右[遼寧長生生物技術(shù)有限股份公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，合格證號(hào)：211002300062682]。

1.1.2 試劑：miR-26a siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物、RT試劑盒熒光定量PCR試劑(Western Biotechnology 公司)；兔多克隆抗caspase-3抗體、鼠單克隆抗Bax抗體、兔多克隆抗RhoA抗體、鼠單克隆抗ROCK1抗體、兔多克隆抗GAPDH抗體、山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：用隨機(jī)數(shù)表將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=20)、I/R組(n=20)和siRNA組(n=20)。siRNA組大鼠尾靜脈注射4 mL/kg的miR-26a siRNA。7 d后建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷(I/R)模型，每組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，并將套管插入左頸動(dòng)脈測(cè)量大鼠血壓。使用雙導(dǎo)聯(lián)心電圖儀(electrocardiogram，ECG)監(jiān)測(cè)心率。然后在第四肋間切開胸腔，切除心包暴露心臟。在左心耳上方2 mm處用6-0絲線結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈(left anterior descending coronary artery，LAD)，誘導(dǎo)局部心肌缺血。缺血后30 min，絲線松解，再灌注2 h，對(duì)照組大鼠同樣進(jìn)行手術(shù)，但未用絲線結(jié)扎LAD。再灌注后，處死大鼠，取左室前壁心肌組織于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-26a表達(dá)：Trizol試劑提取心肌組織中總RNA，測(cè)定總RNA的濃度及純度，A260/280在1.8～2.0提示純度良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。定量后按試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-26a相對(duì)表達(dá)水平。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.2.3 2,3,5-三苯基四唑氯化物(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色檢測(cè)心肌梗死面積：用磨具將新鮮心肌組織切成切片，-20 ℃冷凍30 min。心肌組織切成2 mm厚的切片(每個(gè)組織不超過6個(gè)切片)。然后將切片放入新鮮的TTC溶液(2%)中孵育不少于0.5 h。0.5 h后取出切片，用4%多聚甲醛固定并拍照。

1.2.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟功能：采用Mylab 30 CV超聲系統(tǒng)和10 MHz線性超聲換能器進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，以檢測(cè)各組大鼠的心臟功能。剪掉胸毛后，將大鼠麻醉并放置在37 ℃的加熱板上，左側(cè)朝上。然后檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF%)、縮短分?jǐn)?shù)(fraction shortening,FS%)和心率(heart rate,HR)。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)：取心臟組織置于10%甲醛中過夜，脫水后石蠟包埋。所有心肌組織切片5 μm厚，固定于載玻片上，烘干，染色。按照說明書，切片分別用二甲苯、乙醇和蘇木精浸泡，用樹脂密封。干燥后在光鏡下觀察心肌細(xì)胞、心肌間質(zhì)和肌絲的形態(tài)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Bax、caspase-3、RhoA及ROCK1蛋白表達(dá)水平：在溶解緩沖液中充分研磨心肌組織，然后超聲溶解。離心溶解緩沖液，取上清液置于離心管中。采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將蛋白質(zhì)樣品定量至相同濃度。將蛋白質(zhì)分裝并置于-80 ℃冰箱中。提取總蛋白質(zhì)后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在4 ℃下與一抗孵育過夜，然后在黑暗處再次與二抗孵育1 h。設(shè)置曝光參數(shù)，進(jìn)行圖片采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-26a在心肌組織中的表達(dá)

I/R組心肌組織miR-26a表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)。siRNA組梗死區(qū)miR-26a的表達(dá)水平明顯受到抑制(P<0.05)，表明成功誘導(dǎo)了miR-26a沉默大鼠模型(圖1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖1 miR-26a在I/R心肌損傷中的表達(dá)Fig 1 Expression of miR-26a in myocardial I/R

2.2 超聲心動(dòng)圖檢查大鼠心功能變化

miR-26a沉默后，I/R引起的心臟結(jié)構(gòu)異常改變明顯改善。此外，miR-26a沉默使I/R損傷大鼠的FS%和EF%顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR-26a沉默對(duì)心臟病理結(jié)構(gòu)的影響

I/R組心肌細(xì)胞明顯水腫，肌絲排列紊亂，有不同程度的降解和壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤。miR-26a沉默后，心肌組織水腫明顯減輕，肌絲異常也明顯改善(圖3)。

圖3 降低miR-26a表達(dá)對(duì)心臟病理結(jié)構(gòu)的影響Fig 3 Effect of decreased miR-26a expression on cardiac pathological structure

2.4 心肌梗死面積的變化

I/R組心肌梗死面積百分比高于對(duì)照組(P<0.05)，siRNA組心肌梗死面積百分比顯著回降(P<0.05)(圖4)。

2.5 心肌細(xì)胞凋亡水平

I/R組心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，miR-26a沉默后，凋亡心肌細(xì)胞數(shù)明顯回降(P<0.05)(圖5)。

2.6 心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

I/R組Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)，siRNA組與I/R組相比Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)(圖6)。

2.7 miR-26a對(duì)心肌Rho/RhoA信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

I/R組蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，siRNA組心肌組織中RhoA和ROCK1的蛋白表達(dá)水平顯著低于I/R組(P<0.05)(圖7)。

3 討論

I/R是心肌梗死或心臟手術(shù)后心力衰竭的主要原因，其特點(diǎn)是高發(fā)病率和死亡率[4]?？焖倩謴?fù)冠狀動(dòng)脈的正常血供是減少心肌損傷的唯一有效方法，但心臟I/R本身也會(huì)導(dǎo)致額外的心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)一步擴(kuò)大心肌梗死面積。導(dǎo)致心肌I/R損傷的因素主要包括氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和凋亡[5-7]。心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞會(huì)大量消耗三磷酸腺苷從而降低肌漿網(wǎng)吸收Ca2+的能力， 導(dǎo)致線粒體中Ca2+大量積累[8]。心肌細(xì)胞I/R過程中，氧重新進(jìn)入心肌細(xì)胞，導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈損傷， 從而增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生。線粒體中Ca2+超載和ROS生成會(huì)促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞壞死和凋亡[9]。上述結(jié)果表明，線粒體作為能量供應(yīng)的細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2+緩沖系統(tǒng)和活性氧產(chǎn)生的主要來源，也是細(xì)胞存活和死亡的決定因素。因此，抑制I/R時(shí)心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善心肌線粒體功能，可有效逆轉(zhuǎn)I/R所致的心功能不全，減少梗死面積。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖2 各組大鼠的心臟組織結(jié)構(gòu)和心功能變化(超聲心動(dòng)圖)Fig 2 Changes of cardiac tissue structure and function of rats in each

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖4 心肌梗死面積的變化Fig 4 Changes of myocardial infarction area

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖5 心肌細(xì)胞凋亡水平比較Fig 5 Comparison of cardiomyocyte

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖6 心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 6 Expression of apoptosis related proteins in

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是指在生理或病理?xiàng)l件下， 由基因控制的維持體內(nèi)平衡的程序性死亡[10]。研究表明， 心肌梗死時(shí)多種凋亡誘導(dǎo)信號(hào)被激活，導(dǎo)致梗死區(qū)心肌細(xì)胞水腫、凋亡或壞死。心肌梗死后前6 h，心肌細(xì)胞主要以壞死的形式死亡，其后以凋亡的形式死亡[11]。在心血管領(lǐng)域，miRNAs被認(rèn)為是調(diào)控生理和病理狀態(tài)下心肌應(yīng)激基因表達(dá)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)先前的一項(xiàng)研究，miR-26a在大鼠心臟組織中大量表達(dá)，在缺血預(yù)處理中有所下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-26a在I/R大鼠心肌組織中高表達(dá)，沉默miR-26a可顯著改善I/R大鼠的心功能，表現(xiàn)為EF%和FS%均顯著升高。此外，沉默miR-26a可明顯降低I/R大鼠的心肌梗死面積，減少凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量，降低促凋亡基因Bax和caspase-3的表達(dá)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group圖7 miR-26a對(duì)心肌Rho/RhoA信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effect of miR-26a on the expression of Rho/RhoA signaling pathway in

最后，研究發(fā)現(xiàn)miR-26a可以靶向抑制Rho/RhoA信號(hào)通路中RhoA及其下游肺內(nèi)高度表達(dá)的效應(yīng)底物ROCK1的蛋白表達(dá)水平，因此沉默miR-26a可以激活Rho/RhoA信號(hào)通路。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-26a沉默可減輕I/R引起的心臟功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡。