馮燕輝 熊娟 黎燁 張婷 程林潔 金玲月 張沁怡 藍燦華 田寶玉

摘 要：為了解析具有不同IAA分泌特性的促生菌在植物體內(nèi)的存在模式及其促生機制。以不可產(chǎn)IAA的植物促生菌Lysinibacillus xylanilyticus CZ29和可產(chǎn)IAA的植物促生菌Rhizobium radiobacter GF12為材料，分別接種于盆栽新中蔬四號番茄幼苗根部，以不接種菌株為對照，采用基于細菌16S rRNA基因V5～V7可變區(qū)高通量測序的方法，分析2種不同促生菌在植物根內(nèi)定植情況及其對生長得到促進的植物根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果顯示：接種2株促生細菌之后，這2株促生菌在生長得到促進的植物根內(nèi)的定植量無顯著變化，說明促生菌接種的促生長作用并非是通過接種促生菌的定植量增加而實現(xiàn)。且經(jīng)2種不同促生菌分別接種處理后生長得到促進的番茄根內(nèi)生菌物種豐富度（Chao1指數(shù)）以及細菌多樣性（Shannon指數(shù)）相對于對照以及相互之間均沒有顯著差異性（P>0.05），表明這2株促生菌的促生長作用與內(nèi)生菌菌群豐富度和多樣性沒有直接聯(lián)系?；贠TU水平的層次聚類和PLS-DA等分析表明，2株促生菌接種均可顯著影響番茄根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成，導致原有的內(nèi)生菌菌群平衡被打破但其具體的影響不同。其中，接種不可產(chǎn)IAA的植物促生菌L.xylanilyticus CZ29的組別中Roseateles、Sphingobium和Rhizobium益生菌受到顯著富集;Myroides、Chryseobacterium、Achromobacter及Strenotrophomonas致害菌被顯著抑制（P<0.05）。接種可產(chǎn)IAA的植物促生菌R.radiobacter GF12的組別中各菌屬菌群平均豐度與對照相比波動都不明顯，菌群結(jié)構(gòu)與對照更為相似并表現(xiàn)出內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成更加穩(wěn)定的特點。因此推測，不可產(chǎn)IAA的植物促生菌L.xylanilyticus CZ29是通過富集益生菌抑制有害菌從而促進植物生長?？僧a(chǎn)IAA的植物促生菌R.radiobacte GF12則是通過同時上調(diào)植物內(nèi)生菌各主要菌群的豐度從而構(gòu)建更加穩(wěn)定的內(nèi)生菌群增大植物的抗刺激能力及分泌IAA而促進植物生長。

關(guān)鍵詞：植物促生菌;接種;內(nèi)生菌;菌群結(jié)構(gòu);高通量測序

中圖分類號：S 641.2 ? 文獻標志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2021）06-0006-09

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.06.002

Abstract： In order to analyze the existence pattern and growth-promoting mechanism of the growth-promoting bacteria with different IAA secretion characteristics in plants， Lysinibacillus xylanilyticus CZ29， the plant growth-promoting bacteria that could not produce IAA， and Rhizobium radiobacter GF12， the plant growth-promoting bacteria that could produce IAA， were used as the materials to be inoculated in the roots of potted tomato seedlings， Xinzhongshu No.4， and the high-throughput sequencing based on the variable region of the bacteria 16S rRNA gene V5-V7 was used to analyze the colonization of the two different growth-promoting bacteria in plant roots whose growth has been promoted and their effect on the structure and diversity of endophytic bacterial flora in plant roots. The results showed that after inoculating the two growth-promoting bacteria， the colonization of the two growth-promoting bacteria in the plant roots whose growth has been promoted did not change significantly， indicating that the growth-promoting effect of the growth-promoting bacteria inoculation was not achieved by increasing the colonization of the inoculated strains. After the inoculation with two different growth-promoting bacteria respectively， there was no significant difference （P>0.05） between the species richness （Chao1 index） and bacterial diversity （Shannon index） of endophytes in tomato roots compared to the control group and between each other， which showed that the growth-promoting effect of these two growth-promoting bacteria was not directly related to the richness and diversity of endophyte flora. The analysis of hierarchical clustering based on OTU level and PLS-DA showed that the inoculation of the two growth-promoting bacteria could significantly affect the composition of the endophyte flora in tomato root， causing the balance of the original endophytic flora to be broken but the specific effects were different. Among them， the probiotics such as Roseateles， Sphingobium and Rhizobium were significantly enriched in the group inoculated with L.xylanilyticus CZ29， the plant growth-promoting bacteria that could not produce IAA; the harmful bacteria such as Myroides， Chryseobacterium， Achromobacter and Strenotrophomonas were significantly inhibited （P<0.05）. In the other experimental group inoculated with R.radiobacter GF12， the plant growth-promoting bacteria that could produce IAA， the average abundance of each bacterial genus did not fluctuate significantly compared with the control group， and the microbial community structure was more similar to that of the control group and showed a more stable structure. Therefore， it was hypothesized that L.xylanilyticus CZ29， the plant growth-promoting bacteria that could not produce IAA， promoted the plant growth by inhibiting the harmful bacteria through the enrichment of probiotics， while Rhizobium radiobacter GF12， the plant growth-promoting bacteria that could produce IAA， promoted the plant growth by simultaneously up-regulating the abundance of the main flora of plant endophytes to construct a more stable endophytic flora， thus to increase the anti-irritating ability of plants and secrete IAA.

Key words： Plant growth-promoting bacteria; Inoculation; Endophyte; Microbial community structure; High-throughput sequencing

植物內(nèi)生菌是指其生活史的某一階段或全部過程生活于植物各種組織、器官內(nèi)部或細胞間隙但不導致明顯病害的真菌或細菌[1-3]，其主要通過從表面嚴格消毒的植物組織中分離得到[2]，既包括中性菌、促生菌，也包括某些潛伏的或條件致病的病原微生物[3-4] ，盡管如此，目前還是普遍認為植物內(nèi)生菌在植物生長、發(fā)育以及健康中發(fā)揮著重要作用[3-5]。比如一些促生菌長期穩(wěn)定定植于植物體內(nèi)并與宿主形成一種互利共生的關(guān)系，使植物具有例如內(nèi)生固氮、溶磷、抗病害等優(yōu)勢[1，3，5-6]，并在全球氣候變暖、大量優(yōu)質(zhì)農(nóng)業(yè)用地喪失、全球農(nóng)作物面臨巨大環(huán)境壓力的今天，起到促進植物生長并緩解植物生長壓力的作用[7]。但是，在自然界中植物促生菌的來源十分有限。大量的研究數(shù)據(jù)表明，每克根的根內(nèi)生環(huán)境中的細菌量只有104～108個，植物內(nèi)生菌無論是從數(shù)量上還是物種多樣性上都遠遠少于土壤和植物根際細菌[10-12]，且植物宿主根周圍的土壤微生物中也僅2%～5%的具有根際定植能力的自由細菌可侵入根部成為促生菌[8-12]。

現(xiàn)有的研究表明，接種特定根促生細菌是改善植物根際和內(nèi)生細菌促生作用的有效手段。如，Ke等[13]在兩種水分條件下，研究了內(nèi)生假單胞菌A1501接種玉米后對植株生長和植株含氮量的影響;Barriuso等[14]研究10種植物促生長根細菌（PGPR）對松果體生長和菌根生長的促進作用，均證明了促生菌的接種對植物生長有明顯促進作用。盡管如此，目前對促生菌引入后其在植物體內(nèi)的存在模式及其對植物內(nèi)生菌的影響和真正的促生機制的報道仍舊較少且尚不夠深入[15-17]。與此同時，近年來伴隨著基于核糖體rRNA基因的宏基因組測序和分析技術(shù)的快速發(fā)展，對國內(nèi)占全年蔬菜栽培總面積15%左右[18-19]的番茄植物的根內(nèi)生菌種群組成及其多樣性有了更為深入的了解[9，19]，并從中鑒別出了大量豐富且功能多樣的促生細菌，包括抑菌、鐵載體產(chǎn)生、固氮以及依賴IAA產(chǎn)生的植物生長促進細菌等[20-22]。

因此，本研究在前期解析番茄根微生物組菌群結(jié)構(gòu)組成，以及根內(nèi)生菌分離、鑒定和活性篩選的基礎(chǔ)上，挑選2株具有不同IAA分泌特性的促生菌株研究促生菌接種后生長得到促進的番茄植物根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，旨在解釋具有不同IAA分泌特性的接種促生菌在植物體內(nèi)的存在模式及其促生機制，從而為在實踐上構(gòu)建健康的植物內(nèi)生微生物組及發(fā)展高效的微生物肥料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 實驗室前期在番茄根際分離出的2株具有不同IAA分泌特性、對番茄植株具有同等程度促生效果的促生菌，分別為Lysinibacillus xylanilyticus CZ29和Rhizobium radiobacter GF12，其中R.radiobacter GF12具有利用色氨酸分泌IAA的能力，而L.xylanilyticus CZ29則無;FastDNASpin Kit試劑盒。

1.1.2 儀器與設(shè)備 IonSSTMXL測序平臺;Illumina Miseq高通量測序平臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種試驗 通過用等濃度的2株菌菌液分別浸泡10粒番茄種子并于盆栽土中播種，同時菌液均勻撒在種子周圍土壤中，設(shè)置不添加任何微生物對照組，同時試驗組、對照組各3個重復。

1.2.2 樣品采集及測定 番茄生長1個月后收集每盆長勢最好的植株根為一個樣，共9個樣品。緊接著將番茄根表面消毒后收集到無菌離心管中，按照FastDNASpin Kit試劑盒中要求提取總基因組DNA作為細菌16S rRNA的PCR擴增模板，采用IonSSTMXL測序平臺的V5～V7引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物純化后，擴增子送交上海生物工程科技有限公司進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

擴增子交由上海生物工程科技有限公司進行Illumina Miseq高通量測序。檢測數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列。利用cutadapt（version 1.2.1）軟件去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間overlap關(guān)系，利用pear（version 0.9.6）軟件將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后用Prinseq（version 0.20.4）軟件對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。還要使用Usearch（version5.2.236）去除預處理后序列中非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調(diào)用Uchime（version 4.2.40）進行鑒定嵌合體。隨后，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進行blastn比對，低于閾值的比對結(jié)果認為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列，得到最終有效序列。

使用97%相似度的OTU，利用Mothur（version 1.30.1）做rarefaction分析，用R制作曲線圖從而分析數(shù)據(jù)合理性。利用RDP classifier（version 2.12）對OTU進行物種分類，并用blastn將OTU序列與對應數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進行過濾，根據(jù)OTU表繪制各個樣品不同分類水平物種結(jié)構(gòu)組成柱狀圖，更加直觀地看出樣本間的關(guān)系及物種構(gòu)成。采用Alpha多樣性指標的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。采用PLS-DA分析來評估樣本β多樣性及不同樣本群落組成相似性和差異等。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株促生菌在番茄根內(nèi)的定植情況評估

通過受試促生菌的16S rDNA序列與9個樣品的Illumina測序聚類的OTU相應序列比對發(fā)現(xiàn)，OTU 18與L.xylanilyticus GF12、OTU 409與R.radiobacter CZ29的序列一致性高達99%（圖1），說明OTU 18與OTU 409分別為L.xylanilyticus GF12和R.radiobacter CZ29在樣品中的OTU。對比其OTU豐度在對照組和試驗組中的變化（表1），OTU豐度在相應的處理中沒有明顯增加（P>0.05），表明2種促生菌接種后它們的定植量無顯著變化，因而促生菌接種的促生長作用并非是通過接種菌株的定植量增加而實現(xiàn)。

將這2株促生菌的菌群豐度在組內(nèi)進行統(tǒng)計學比較，結(jié)果顯示，在對照組中，Rhizobium與Lysinibacillus無顯著區(qū)別，于GF12組中也無顯著差異，反倒是CZ29組中的Rhizobium豐度（平均3.15%）極其顯著地（P<0.01）高于組中的Lysinibacillus（平均0.25%）。除此之外，分別對Rhizobium和Lysinibacillus在3組中的分布進行對比，也僅發(fā)現(xiàn)被R.radiobacte CZ29侵染的組別中Rhizobium得到顯著富集，充分說明了不管在組間還是組內(nèi)，Rhizobium侵染、定植能力都更強（圖2）。

2.2 促生菌接種對番茄根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

本研究利用blastn將OTU序列與對應數(shù)據(jù)庫進行比對，共注釋到20個門分類與373個屬分類，其中，各樣品相對豐度較高的前14個門與屬分別占據(jù)了99%和68%以上。由此，對不同樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)在門和屬分類水平上的結(jié)果進行對比發(fā)現(xiàn)，在門水平下，番茄根內(nèi)生菌菌群主要由Proteobacteria（73.44%±12.60%）、Bacteroidetes（8.10%±3.71%）、Actinobacteria（11.48%±12.89%）和Firmicutes（6.18%±1.92%）等構(gòu)成。相對于對照組，經(jīng)促生菌接種的2個組別中的Proteobacteria菌門平均相對豐度均增長8%左右，F(xiàn)irmicutes菌門則均減少約2%，漲落幅度大體一致。總體上，經(jīng)促生菌侵染后的處理組在大部分門的豐度上與對照組相比沒有顯著性差異。但仍可以從圖2a看出，2株促生菌接種在門水平下對番茄根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成的影響存在著一定程度的差異，可分泌IAA促生菌接種所帶來的影響似乎更?。▓D2a），這一推測也在屬水平下的統(tǒng)計數(shù)據(jù)中得到了驗證。統(tǒng)計結(jié)果顯示，屬水平下的CZ29組中Roseateles（8.24%±1.30%）、Sphingobium（6.72%±1.94%）和Rhizobium（3.15%±1.49%）較于對照（平均豐度分別是0.33%±0.03%、0.44%%±0.62%、0.42%%±0.17%）得到了顯著富集（P<0.05）;Myroides（0）、Chryseobacterium（0.001%±0.01%）、Achromobacter（0.03%±0.05%）及Strenotrophomonas（0.04%±0.01%）與對照（平均豐度分別為1.72%±0.62%、1.97%±3.18%、1.84%±0.69%、18.66%±5.71%）比則被抑制（P<0.05），Strenotrophomonas僅有對照的0.2%，相反，GF12組各菌屬菌群平均豐度波動則都不明顯（圖2b）。因此，推斷L.xylanilyticus GF12與R.radiobacte CZ29接種后對植物生長發(fā)育的促生效果雖然基本相同但其促生機制不同。

2.3 促生菌接種對番茄根內(nèi)生菌菌群豐富度和多樣性的影響

9個樣品經(jīng)質(zhì)量控制后，共獲得L.xylanilyticus CZ29處理的167366個、R.radiobacte GF12處理的132009個和對照組的136479個有效序列，共2412種OTU。并由稀釋性曲線可知，多數(shù)樣本序列數(shù)在接近10000個時，OTU已經(jīng)接近飽和，說明再增加測序量對于發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻很小，說明測序數(shù)據(jù)量合理，所含菌種數(shù)較多?，F(xiàn)有測序量已經(jīng)可以反映出樣品中細菌豐度信息，滿足進一步分析要求。同時，所有樣本的測序Coverage指數(shù)都大于0.99，說明根際內(nèi)生菌樣品文庫種序列基本都被測出，未被測到的概率較低，測序結(jié)果可以反映樣品真實情況。圖3 Alpha多樣性分析表明，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)在三組處理間差異不顯著（P>0.05）。其中，CZ29組Shannon指數(shù)（3.94）、Chao1指數(shù)（824.65）最高，群落豐富度及多樣性最大，GF12組的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)（2.93、587.80）最低，因而相對其他兩個組別經(jīng)R.radiobacte GF12侵染后的番茄根內(nèi)生菌菌群的優(yōu)勢菌突出且豐度更高（圖3）。

2.4 促生菌接種對番茄根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)和β多樣性的影響

樣本與物種關(guān)系圖顯示了屬水平上豐度最高的優(yōu)勢類群與不同組樣品的關(guān)聯(lián)關(guān)系。圖4中顯示，部分的優(yōu)勢種群在樣本中分布相對較不均勻，Bacteroidetes菌門的Myroides與GF12組相關(guān)度更高;Proteobacteria菌門的Stenotrophomonas與CZ29組根樣品相關(guān)度極低，而在其他兩組樣品中有明顯優(yōu)勢，以上表明促生菌的處理確實對內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響（圖4）。同時數(shù)據(jù)也表明L.xylanilyticus CZ29和R.radiobacte GF12促生菌處理對植物根內(nèi)生細菌菌群結(jié)構(gòu)組成均有明顯影響（ANOSIM：R=0.626，P=0.022）?；诓煌瑯悠肺锓N組成相似性的PLS-DA分析，CZ29組、GF12組、對照組在第一主成分（21.31%）和第二主成分（11.22%）上均存在一定的相對距離，也補充說明了3組樣品間存在差異（圖5a）。除此之外，OTU水平的Bray-Curtis分析結(jié)果顯示（圖5b）：9個樣品聚為2類，且兩類差異性明顯;其中CZ29_1、CZ29_2和CZ29_3聚為一支，其他樣品聚為另一支;另一支下又分為兩小支，GF12_1和GF12_3聚為一小支，GF12_2和CO_1、CO_2、CO_3聚為另一小支，表明盡管2株促生菌接種均打破了番茄根內(nèi)原有內(nèi)生菌群的平衡，但被R.radiobacte GF12促生菌處理后的番茄根內(nèi)生菌的群落卻與對照組更為相似。

3 結(jié)論與討論

部分內(nèi)生菌普遍存在于大多數(shù)植物中，并提供天然益處，目前大多數(shù)的研究報道表明，內(nèi)生菌的有益作用主要是來自促生菌同時具備固氮能力或分泌IAA等促生特性的影響[23-30]，然而促生菌侵染并定植于內(nèi)生菌群是一個非常復雜的過程，其影響因素眾多，如植物、土壤條件、生物地理學因素等，因此直至現(xiàn)在關(guān)于促生菌的促生機制研究仍不夠明了，同時現(xiàn)階段促生菌接種相關(guān)研究多集中于對根際土壤微生物影響上[31]。故本研究通過高通量分析2株具有相同促生效果、不同產(chǎn)IAA特性的促生菌接種對植物根內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)和多樣性影響，旨在解釋接種促生菌導致的菌群變化的促生作用，以期對促生菌促生機制的研究提供參考。

（1）芽孢桿菌和根瘤菌是常見的促生細菌[32]，本試驗中2株促生菌在番茄根內(nèi)的定植情況評估結(jié)果表明，接種2株促生細菌之后，它們的定植量無顯著變化，因而促生菌接種的促生長作用并非是通過接種菌株的定植量增加而實現(xiàn)。且從數(shù)據(jù)可以看出，Rhizobium較于Lysinibacillus表現(xiàn)出了更強的侵染和定植能力。

（2）Alpha多樣性分析中Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)相對于對照以及相互之間差異不顯著（P>0.05），說明這2株促生菌的促生長作用與內(nèi)生菌菌群豐富度、多樣性不存在明顯相關(guān)，然而在韋江璐等人的促生菌對土壤細菌群落功能多樣性的影響的研究中，各菌株處理后土壤細菌群落物種豐富度指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)卻均顯著高于對照[33]，說明相對于土壤細菌來說，植物內(nèi)生菌群對外來刺激更能表現(xiàn)出防御能力并具有相對穩(wěn)定性。比較三組中Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)分布可得，CZ29組Shannon指數(shù)（3.94）、Chao1指數(shù)（824.65）最高，群落豐富度及多樣性最大，而GF12組的（2.93、587.80）最低，因而相對其他兩個組別經(jīng)R.radiobacte GF12侵染后的番茄根內(nèi)生菌菌群的優(yōu)勢菌突出且豐度更高，內(nèi)生微生物群的結(jié)構(gòu)組成趨于穩(wěn)定。

（3）基于OTU水平的層次聚類和PLS-DA等分析顯示，2株促生菌接種顯著影響了番茄根內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成，但其影響結(jié)果不同。在屬水平下，L.xylanilyticus CZ29侵染的組中Roseateles、Sphingobium和Rhizobium益生菌受到顯著富集;Myroides、Chryseobacterium、Achromobacter及Strenotrophomonas致害菌則被大量抑制，而GF12組的各菌屬菌群平均豐度相較于對照波動則都不明顯。結(jié)合以上的結(jié)果，經(jīng)R.radiobacte GF12侵染后的番茄根內(nèi)生菌菌群的優(yōu)勢菌突出且豐度更高，內(nèi)生微生物群的組成更加趨于穩(wěn)定。綜上所述，推測L.xylanilyticus CZ29促生菌是通過富集益生菌抑制有害菌從而促進植物生長的。R.radiobacte GF12則是通過同時上調(diào)植物內(nèi)生菌各主要菌群的豐度從而構(gòu)建更加穩(wěn)定的內(nèi)生菌群增大植物的抗刺激能力并分泌IAA而促生。

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（責任編輯：柯文輝）