邱 華,林棟毅,李錦源

邱華,林棟毅,李錦源,廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍是全球重要的公共衛(wèi)生問題,每年將近100萬人死于HBV感染相關(guān)的肝硬化、肝癌及肝衰竭等疾病,而中國作為世界上HBV感染者最多的國家,防控壓力尤為沉重.HBV體外感染與復(fù)制模型是研究HBV生活史、致病機(jī)理、傳染途徑的重要工具,并在HBV相關(guān)肝硬化和肝癌的發(fā)病機(jī)制探索、治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和候選藥物篩選等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1].因此,構(gòu)建一種高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性的HBV體外細(xì)胞模型具有重要的意義.而對于HBV體外復(fù)制模型來說,目前主要是通過各種病毒載體遞送系統(tǒng),將HBV基因組轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系的Huh7和HepG2細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建而成,如HepG2.2.15、HepAD38、HepDE19等.本課題組前期采用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了HBV全基因組1.3倍體HepG2瞬染細(xì)胞模型,該模型在感染第2天即可分別在上清液和細(xì)胞內(nèi)中檢測出HBV DNA、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(covalently closed circular DNA,cccDNA)、HBsAg及HBeAg等標(biāo)志物的表達(dá),在4-6 d達(dá)到峰值水平,7 d之后逐漸下降[2].但由于該模型HBV DNA不是整合到HepG2細(xì)胞的基因組中,因此其表達(dá)HBV生物標(biāo)志物是不穩(wěn)定的,且隨著時(shí)間延長其表達(dá)活性會自然衰減,每次使用時(shí)都需重新構(gòu)建.有鑒于此,本項(xiàng)目組擬采用重組慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),構(gòu)建并篩選出HBV1.3倍(1.3-fold HBV)基因組HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型的優(yōu)勢單克隆株,以更好服務(wù)于HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療藥物研究.

1 材料和方法

1.1 材料 HepG2細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞、293A細(xì)胞、293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;包裝質(zhì)粒Packaging Mix購自江蘇百奧生物技術(shù)有限公司;0.05%Trypsin購自上海玉博生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司;慢病毒骨架載體pLenti-BSD載體購自上海諾百生物科技有限公司;胎牛血清購自法國Biowest公司;Opti-MEM 購自美國GIBCO公司;Trizol Reagent、熒光染料SYBR Green Ⅰ、oligo dT/Random primer/特異性引物、逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅢReverse Transcriptase、Platinum Taq DNA Polymerase、100mM dNTPs、DEPC H2O購自美國invitrogen公司;Rnase Inhibitor購自加拿大Fermentas公司;HBsAg、HBeAg檢測試劑盒購自鄭州安圖生物股份有限公司(批號:20191103).CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;熒光定量PCR儀購自美國Bio Rad公司.基因序列、PCR引物合成、測序由上海諾百生物科技有限公司完成.

1.2 方法 本研究嚴(yán)格遵循《中華人民共和國生物安全法》中“病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全”的相關(guān)法律規(guī)定進(jìn)行管理與操作.

1.2.1 1.3-fold HBV基因組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建:(1)1.3-fold HBV基因組序列擴(kuò)增:通過NCBI檢索,查出HBV全基因組序列(NC_003977.2),并確定1.3-fold HBV基因組序列(圖1).按照序列設(shè)計(jì)oligo,全基因合成1.3-fold HBV的序列,將1.3-fold HBV序列插入到慢病毒骨架載體pLenti-BSD的ClaI和MluI切點(diǎn)之間,獲得慢病毒載體pLenti-BSD-1.3-fold HBV(圖2).根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)In-fusion引物,引物5’端引物重組必需的序列,上游引物(F):AATTCAAAATTTTATCGATcTCGAGttcaatct aagcaggct,下游引物(R):TTACTAACCGGTACGCGTg cggccGCgatctcgtactgaagg.擴(kuò)增體系:10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 5 μL、Mg2+3 μL、Primer F/R 1.5 μL、模板1 μL、KOD 1 μL,加水至50 μL.擴(kuò)增條件:94 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s,28個(gè)循環(huán).擴(kuò)增產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,PCR產(chǎn)物記為 1.3-fold HBV(PCR);(2)1.3-fold HBV PCR產(chǎn)物回收以及In-fusion連接:pLenti-BSD質(zhì)粒在37 ℃進(jìn)行雙酶切,酶切條件:pLenti-BSD 2 μg、10×Buffer T 5 μL、SalI 2 μL、BglII 2 μL,加水至50 μL.酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收,回收產(chǎn)物記為pLenti-BSD(ClaI/MluI).pLenti-BSD(ClaI/MluI)和1.3-fold HBV DNA(PCR)通過In-fusion連接,連接產(chǎn)物記為pLenti-BSD-1.3-fold HBV.連接體系:5×CE II Buffer 4 μL、pLenti-BSD(ClaI/MluI)50 ng、HBV DNA 1.3P(PCR)150 ng、Exnase? Ⅱ 2 μL,加入至20 μL,混勻.連接條件:37 ℃反應(yīng)30 min后,立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻;(3)pLenti-BSD-1.3-fold HBV重組質(zhì)粒鑒定:pLenti-BSD-1.3-fold HBV連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃過夜培養(yǎng),挑取陽性克隆經(jīng)PCR鑒定,根據(jù)1.3-fold HBV序列設(shè)計(jì)特異性引物(F:CTCGTGGTGGACTTCTCTC;R:CAGCAGGATGAAGAGGAA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為166bp;同時(shí)設(shè)置陰性對照(dd H2O作為模板)和陽性對照(PCR擴(kuò)增1.3-fold HBV);PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照1.2.1.1;(4)pLenti-BSD-1.3-fold HBV慢病毒包裝及滴度測定:將慢病毒載體pLenti-BSD-1.3-fold HBV和包裝質(zhì)粒(packaging mix)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝病毒,收集病毒原液,超速離心濃縮,濃縮后的慢病毒侵染293A細(xì)胞,48 h后qPCR測定慢病毒活性滴度[2].qPCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 1 μL、Mg2+0.4 μL、dNTPs 0.2 μL、Primer F/R 0.5 μL、Probe(FAM)0.25 μL、Taq酶0.1 μL、Template 1 μL、Total volume 10 μL;qPCR反應(yīng)條件:95℃10 s、60 ℃30 s,40個(gè)循環(huán).

圖1 1.3-fold HBV基因組序列.

圖2 pLenti-BSD-1.3-fold HBV慢病毒載體示意圖.

1.2.2 HBV 1.3倍基因組慢病毒質(zhì)粒侵染HepG2細(xì)胞及篩選:(1)慢病毒載體pLenti-BSD-1.3-fold HBV侵染HepG2最佳MOI值:培養(yǎng)靶細(xì)胞HepG2至狀態(tài)良好,處于對數(shù)生長期;細(xì)胞用0.05%胰酶消化,用含8 μg/mL polybrene的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,按照每孔第2天細(xì)胞密度60%-70%的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行接種于96孔板的每個(gè)孔中,設(shè)置1個(gè)復(fù)孔(病毒滴度設(shè)1復(fù)孔);培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)胞生長狀態(tài).進(jìn)行GFP熒光慢病毒侵染實(shí)驗(yàn);取出已知滴度的陰性對照病毒液,冰上融化,根據(jù)設(shè)計(jì)的MOI測定范圍,以及細(xì)胞接種量,計(jì)算每孔所需要病毒量,按照不同感染復(fù)數(shù)(multiplication of infection,MOI),慢病毒MOI=0、2、5、10、30、60、120、240,向每孔加入病毒液.在37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后,更換為完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h-96 h;熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和熒光比率,確定最佳MOI,并拍攝每個(gè)MOI下的白光和熒光視野下的照片;(2)1.3-fold HBV DNA慢病毒侵染HepG2細(xì)胞及抗生素篩選:培養(yǎng)靶細(xì)胞HepG2至狀態(tài)良好,處于對數(shù)生長期;細(xì)胞用0.05%胰酶消化,用完全培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,按照5×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板的每個(gè)孔中;感染培養(yǎng)基預(yù)先配制完全培養(yǎng)基+8 μg/mL ploybrene;培養(yǎng)孔換上新配制的感染培養(yǎng)基,添加1 mL培養(yǎng)基,按照MOI測定值的病毒液侵染靶細(xì)胞,混勻后置于5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6 h,更換新鮮的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h-72 h,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行抗生素篩選(梯度分為0,2 μg/mL,4 μg/mL,6 μg/mL,8 μg/mL,10 μg/mL);完全培養(yǎng)基中加入合適量的抗生素進(jìn)行篩選,篩選期間每天觀察細(xì)胞狀態(tài),抗生素篩選周期視細(xì)胞狀態(tài)而定,篩選成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞按照常規(guī)培養(yǎng)并凍存;(3)1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PCR鑒定:抽提1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的基因組DNA,根據(jù)1.3-fold HBV序列設(shè)計(jì)特異性引物(F:CTCGTGGTGGACTTCTCTC;R:CAGCAGGATGAAGAGGAA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為166 bp;PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照1.2.1.1.

1.2.3 1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞優(yōu)勢單克隆株的篩選及鑒定:(1)1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞候選陽性單克隆的篩選:①鋪板培養(yǎng):取1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株消化重懸計(jì)數(shù),以每孔1個(gè)細(xì)胞量調(diào)整細(xì)胞密度,接種到96孔板中,2周后顯微鏡下觀察已長出的單克隆細(xì)胞團(tuán),收集單克隆細(xì)胞上清并消化擴(kuò)培到24孔板中,24孔板長滿再擴(kuò)培到6孔板中,依次擴(kuò)大培養(yǎng).再取擴(kuò)增后的穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆株分批次鋪板培養(yǎng)并挑選,第一批單克隆依次命名為A1、A2、A3等,第二批單克隆依次命名為B1、B2、B3等,依此類推.②初篩:所有單克隆株均收集細(xì)胞上清,利用HBsAg和HBeAg檢測試劑盒,分別檢測HBsAg、HBeAg表達(dá)水平,初步篩選出陽性單克隆株,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).③復(fù)篩:源于初篩的陽性單克隆株以同一細(xì)胞數(shù)鋪板,培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞上清,再根據(jù)HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平,篩選出9株候選陽性單克隆株,進(jìn)入后續(xù)靶基因插入位置測序及表達(dá)活性等實(shí)驗(yàn);(2)檢測9株候選陽性單克隆1.3-fold HBV基因組整合進(jìn)HepG2基因組位置:通過測序9株候選陽性單克隆細(xì)胞株的側(cè)翼序列,以確定其相應(yīng)的基因組插入HepG2細(xì)胞基因組的位置.培養(yǎng)候選的9株陽性單克隆株至1×106以上,分別抽提基因組DNA;用XspI對基因組DNA進(jìn)行酶切,將酶切后的產(chǎn)物與NdeI切開的pUC57-Amp載體進(jìn)行連接反應(yīng),針對連接產(chǎn)物,進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,第一輪所用的引物F:gttccgcagtatggatcggc,R:cgatcgcccttcccaacagt;第二輪所用的引物F:gaggagccgaaaaggttcca,R:cagcctgaatggcgaatgg.針對巢式PCR產(chǎn)物,進(jìn)行Sanger測序(使用cagcctgaatggcgaatgg為測序引物)將測序獲得的序列信息,與人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對,可找出相應(yīng)的基因組位置信息;(3)篩選出1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢單克隆株:收集9株候選陽性單克隆株細(xì)胞上清,分別檢測上清中HBsAg、HBeAg水平,篩選出表達(dá)量及穩(wěn)定性最優(yōu)的單克隆,作為優(yōu)勢單克隆株,培養(yǎng)備用;(4)檢測優(yōu)勢單克隆株與HepG2.2.15各代HBsAg、HBeAg表達(dá)水平與穩(wěn)定性:取1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢單克隆株和HepG2.2.15細(xì)胞株,各連續(xù)培養(yǎng)20代,分別收集第1代、第2代、第3代、第4代、第5代、第10代、第15代、第20代的細(xì)胞上清,檢測細(xì)胞株上清中HBsAg、HBeAg水平;(5)檢測優(yōu)勢單克隆株與HepG2.2.15各代乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)、cccDNA、HBV DNA的表達(dá)水平及穩(wěn)定性:分別收集兩種細(xì)胞株,連續(xù)培養(yǎng)后,收集第1代、第2代、第3代、第4代、第5代、第10代、第15代、第20代的細(xì)胞,抽提RNA和DNA;采用qPCR檢測HBx mRNA、cccDNA、HBV DNA的表達(dá)水平.HBx的檢測引物為F:tctgtgccttctcatctgc,R:tcggtcgttgacattgctg,cccDNA的檢測引物為F:ctccccgtctgtgccttct,R:gccccaaagccacccaag,HBV DNA的檢測引物為F:ctcgtggtggacttctctc,R:cagcaggatgaagaggaa,以18S rDNA為內(nèi)參,檢測引物為引物F:GAATTGACGGAAGGGCACCAC,R:AAGAACGGCCATGCACCACCA.實(shí)驗(yàn)組與對照組中基因的倍數(shù)關(guān)系以2-ΔΔCt表示 .參考前期反應(yīng)體系[2]:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、Primer F/R 1 μL、模板 1 μL、RNase-free H2O 5 μL;PCR反應(yīng)條件:95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán).檢測過程中以HepG2.2.15細(xì)胞為陽性對照.細(xì)胞按50%密度鋪6孔板(每組細(xì)胞數(shù)一致,約2E+6/孔),培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞并檢測.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用aP＜0.05或bP＜0.01(P＞0.05不注)表示.

2 結(jié)果

2.1 1.3-fold HBV基因組序列擴(kuò)增 1.3-fold HBV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,在4100 bp處可見清晰的條帶,其大小與理論大小一致(圖3).

圖3 PCR鑒定1.3-fold HBV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.2 pLenti-BSD-1.3-fold HBV基因組重組質(zhì)粒鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,鑒定條帶約為166 bp,符合預(yù)期條帶大小(圖4).

圖4 PCR鑒定pLenti-BSD-1.3-fold HBV.

2.3 慢病毒滴度及侵染HepG2細(xì)胞的最佳MOI值測定 濃縮后的慢病毒侵染HepG2細(xì)胞,48 h后抽提細(xì)胞基因組.測定病毒滴度為1.28×108TU/mL.MOI=30時(shí),綜合分析細(xì)胞陽性比例達(dá)到80%以上,細(xì)胞狀態(tài)較好,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求(圖5).

圖5 MOI=30時(shí),慢病毒侵染HepG2細(xì)胞的感染效率(×100).

2.4 1.3-fold HBV慢病毒侵染HepG2細(xì)胞及抗生素篩選HepG2細(xì)胞抗生素最佳篩選劑量為1 μg/mL,篩選時(shí)間為10 d.將慢病毒載體pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI=30的參數(shù)侵染HepG2細(xì)胞,72 h后加入BSD抗生素(終濃度1 μg/mL)進(jìn)行篩選,連續(xù)培養(yǎng)15-20 d后,獲得1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(圖6).

圖6 1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞形態(tài)圖.

2.5 1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PCR鑒定 從1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中擴(kuò)增出預(yù)期的HBV DNA序列(約166bp),符合預(yù)期(圖7).

圖7 1.3-fold HBV-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PCR鑒定.

2.6 各候選陽性單克隆細(xì)胞的側(cè)翼序列對應(yīng)的基因組插入位置 表1.

表1 9株候選陽性單克隆細(xì)胞的側(cè)翼序列對應(yīng)的基因組插入位置

2.7 各候選陽性單克隆細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平 由表2可知,1.3-fold HBV DNA-HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞單克隆A14的HBsAg、HBeAg表達(dá)水平最高,分別為24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL,確定為優(yōu)勢單克隆株,并命名為HepGA14,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(表2).

表2 各候選陽性單克隆細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平比較

2.8 HepGA14優(yōu)勢單克隆株和HepG2.2.15株各代細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平及穩(wěn)定性 由表3可知,HepGA14優(yōu)勢克隆株培養(yǎng)的第1-20代HBsAg、HBeAg濃度均較穩(wěn)定,而HepG2.2.15株培養(yǎng)的第1-20代HBsAg、HBeAg濃度呈逐漸降低趨勢(表3).

表3 HepGA14優(yōu)勢克隆株和HepG2.2.15株各代細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg的表達(dá)水平比較

2.9 HepGA14優(yōu)勢單克隆株和HepG2.2.15株各代細(xì)胞內(nèi)HBx、HBV DNA、cccDNA表達(dá)水平及穩(wěn)定性 HepGA14優(yōu)勢單克隆株培養(yǎng)1-20代的HBx、HBV DNA、cccDNA相對表達(dá)水平均較穩(wěn)定,而HepG2.2.15株HBx、HBV DNA、cccDNA相對表達(dá)水平隨著傳代數(shù)的增加,逐漸降低.HepGA14組各代HBx、cccDNA相對表達(dá)水平均高于HepG2.2.15組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖8、圖9).HepG2.2.15組的HBV DNA相對表達(dá)水平從第15、20代顯著下降,與同代HepGA14比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖10).

圖8 HepGA14和HepG2.2.15各代HBx相對表達(dá)量比較.

圖9 HepGA14和HepG2.2.15各代cccDNA相對表達(dá)量比較.

圖10 HepGA14和HepG2.2.15各代HBV DNA相對表達(dá)量比較.

3 討論

HBV是一種是噬肝病毒屬小包膜DNA病毒,由于其具有嚴(yán)格的種屬限制性及組織親嗜性,宿主范圍狹窄,只能感染人和少數(shù)靈長類動物(如黑猩猩)[3].因此支持HBV感染和復(fù)制的體外細(xì)胞模型就成了研究HBV生命周期、病毒-宿主相互作用、致病機(jī)理及新型抗病毒藥物等的重要工具[4].根據(jù)研究目的、感染途徑等不同又分為可直接感染HBV的細(xì)胞模型和依賴基因工程技術(shù)所建立的重組細(xì)胞系模型2類.對于直接感染HBV的細(xì)胞模型,由于人類原代肝細(xì)胞、胚胎肝細(xì)胞保留了肝細(xì)胞的重要細(xì)胞學(xué)特性,自然條件下允許HBV穿入和完整復(fù)制,能模擬最接近HBV體內(nèi)感染的真實(shí)過程及狀態(tài),相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)占據(jù)著HBV感染模型的主要位置[5].但這類細(xì)胞模型都具有細(xì)胞來源有限,體外培養(yǎng)技術(shù)要求較高且不能連續(xù)擴(kuò)增,生命周期短暫,HBV易感性迅速降低,不同捐贈者之間個(gè)體差異較大等缺點(diǎn),因此只適合于對HBV感染早期階段研究[6].HepaRG細(xì)胞是唯一可直接感染HBV的肝癌細(xì)胞系,增殖能力較強(qiáng),但是感染效率較低且操作復(fù)雜,在誘導(dǎo)分化數(shù)周后才可被感染[7].近年來,隨著鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的發(fā)現(xiàn),使肝癌細(xì)胞系通過外源表達(dá)NTCP直接感染HBV成為了可能[8].NTCP是多次跨膜的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,特異性地在肝細(xì)胞膜表面表達(dá),能與HBV病毒外膜蛋白pre-S1區(qū)域特異性結(jié)合.HepG2、HuH7等傳代細(xì)胞系由于缺乏內(nèi)源性NTCP表達(dá),故在正常培養(yǎng)條件下不能支持HBV感染,但在其中外源性表達(dá)NTCP可恢復(fù)其HBV易感性.以HepG2-NTCP、HuH7-NTCP為代表的新型HBV感染細(xì)胞模型,為針對HBV生命周期早期階段的研究提供了新選擇[9].但該類模型與體內(nèi)感染相比,感染是短暫的,所產(chǎn)生的子代病毒不能有效地在細(xì)胞間傳播,從而限制了其作為HBV病毒源的研究應(yīng)用,且只有少量cccDNA可被檢測到.

同時(shí),為解決研究HBV生命周期中后階段自然史、篩選抑制HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制藥物及獲得穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)源性HBV病毒顆粒等需要,科學(xué)家們采用基因工程技術(shù)建立了系列整合HBV基因組,能持續(xù)擴(kuò)增,高效、穩(wěn)定表達(dá)HBV標(biāo)志物的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型.1987年,Sells等[10]通過將首尾相連的2倍HBV基因組整合進(jìn)入HepG2細(xì)胞,從而構(gòu)建成能穩(wěn)定表達(dá)乙肝病毒顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞系.該細(xì)胞系中HBV可持續(xù)復(fù)制,并能檢測到共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(cccDNA)和松弛環(huán)狀 DNA(rcDNA)的產(chǎn)生;能產(chǎn)生一定量的病毒感染顆粒,將其注射到黑猩猩體內(nèi)可以誘發(fā)顯著的肝炎癥狀[11].該模型已被廣泛用于HBV基礎(chǔ)生物學(xué)問題研究,為早期抗HBV藥物的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn),但該模型存在病毒復(fù)制活性弱、cccDNA表達(dá)水平較低等不足,且隨著培養(yǎng)代數(shù)增多,HBV主要抗原(HBsAg、HBeAg)表達(dá)量會逐漸降低,更難以滿足以cccDNA等為目標(biāo)新型抗病毒藥物研發(fā)的需要.針對HepG2.2.15存在的問題,學(xué)者們將1.1倍的HBV全基因組整合入HepG2細(xì)胞,成功構(gòu)建了HepAD38細(xì)胞模型.該模型HBV的產(chǎn)生受四環(huán)素嚴(yán)格調(diào)控,當(dāng)培養(yǎng)基中含有四環(huán)素時(shí)由于抑制了前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的合成,而無法合成HBV,去除培養(yǎng)基中四環(huán)素后,細(xì)胞立即表達(dá)pgRNA、cccDNA和HBV DNA等標(biāo)志物;同時(shí)HepAD38產(chǎn)生HBV DNA、cccDNA等的量比HepG2.2.15大幅增加[12].但HepAD38對四環(huán)素敏感的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子,與自然感染條件下,HBV通過內(nèi)源啟動子作用下轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的機(jī)制是不同的[13].進(jìn)一步,針對HepAD38存在的問題,科學(xué)家們提出了1.3-fold HBV基因組的解決方案:在HBV1.1倍上游加入其自身啟動子形成的,使其依賴自身啟動子啟動轉(zhuǎn)錄,這樣可以充分反映病毒株的自身復(fù)制情況,便于研究HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的全過程.如HepAD79、HepG2-H1.3整合了1.3倍的HBV全基因組,表達(dá)完全靠HBV自身啟動子,更接近于病毒自然狀態(tài),支持cccDNA形成和完整病毒復(fù)制,但上述模型的病毒產(chǎn)量較低,不能滿足以降解、清除cccDNA為靶點(diǎn)的新型抗病毒藥物研發(fā)的需要[14].

本項(xiàng)目組在前人基礎(chǔ)上,采用慢病毒質(zhì)粒技術(shù)將1.3倍的HBV全基因組整合入HepG2細(xì)胞基因組中,構(gòu)建HBV 1.3倍HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型.由于慢病毒將靶基因插入目標(biāo)細(xì)胞基因組中的位置是隨機(jī)的,而不同的目標(biāo)細(xì)胞基因插入位置,由于自身轉(zhuǎn)錄活性的差異,會對靶基因HBV的表達(dá)水平產(chǎn)生較大影響,故需進(jìn)行優(yōu)勢株的篩選.本項(xiàng)目組以構(gòu)建成功的HBV 1.3倍HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型為基礎(chǔ),按照以下研究步驟:分批次挑選、擴(kuò)增單克隆株→初篩出陽性單克隆株→復(fù)篩出9株候選陽性單克隆株→檢測9株候選陽性單克隆株的基因組插入HepG2基因組的位置→檢測9株候選陽性單克隆株表達(dá)HBsAg、HBeAg的活性及穩(wěn)定性→選出最優(yōu)勢單克隆株→與HepG2.2.15比較該優(yōu)勢單克隆株表達(dá)HBVDNA、cccDNA、HBx、HBsAg、HBeAg等生物標(biāo)志物的活性及穩(wěn)定性,從而進(jìn)一步篩選并鑒定出1.3-fold HBV基因組HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型優(yōu)勢單克隆株.結(jié)果表明,在挑選出的9株候選陽性單克隆中以A14插入HepG2基因組位置為1:166461695-166461715(命名為HepGA14)的HBsAg、HBeAg表達(dá)水平最高,分別為24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL,初步確定為優(yōu)勢單克隆株.以HepG2.2.15細(xì)胞株為對照,進(jìn)一步檢測HepGA14優(yōu)勢單克隆株1-20代表達(dá)HBx、cccDNA、HBVDNA的水平,結(jié)果表明HepGA14能高效、穩(wěn)定地表達(dá)HBV生物標(biāo)志物,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).HepGA14有望為以HBx為功能蛋白的肝纖維化啟動機(jī)制、肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制、HBx-免疫系統(tǒng)跨細(xì)胞競爭機(jī)制等前沿研究奠定基礎(chǔ);為以cccDNA為靶點(diǎn)的新型HBV“治愈”藥物的研發(fā)提供有力的工具,具有積極的應(yīng)用價(jià)值.

4 結(jié)論

綜上,所篩選出的優(yōu)勢單克隆株HepGA14在表達(dá)cccDNA、HBx、HBVDNA、HBsAg、HBeAg等標(biāo)志物的穩(wěn)定性及生物活性上,與常規(guī)的HepG2.2.15細(xì)胞株比較,具有明顯的優(yōu)勢,其有望在新型HBV“治愈”藥物及致病機(jī)制等領(lǐng)域發(fā)揮積極作用.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

慢性乙型肝炎的抗病毒治療已進(jìn)入到要實(shí)現(xiàn)“臨床性治愈”“完全治愈”的新時(shí)代.已知共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(covalently closed circularDNA,cccDNA)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)是導(dǎo)致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染慢性化和難以治愈的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ).但目前尚缺乏能穩(wěn)定、高效表達(dá)上述標(biāo)志物的體外細(xì)胞模型,從而嚴(yán)重限制了以“治愈”為目標(biāo)的藥物篩選及機(jī)制探索.本研究擬采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),以HepG2細(xì)胞為載體,構(gòu)建并篩選出能穩(wěn)定、高效表達(dá)cccDNA、HBx等生物標(biāo)志物的優(yōu)勢單克隆株,以期為以cccDNA為靶點(diǎn)的新型HBV“治愈”藥物研發(fā),以HBx為功能蛋白的肝纖維化啟動機(jī)制、肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制、HBx-免疫系統(tǒng)跨細(xì)胞競爭機(jī)制等探索提供新的研究工具.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

本研究的主題是篩選出HBV1.3倍(1.3-fold HBV)基因組HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型優(yōu)勢單克隆株,并鑒定出該優(yōu)勢單克隆株的HBV基因組整合入HepG2靶細(xì)胞的基因組位置,及其在表達(dá)HBeAg、HBeAg、HBVDNA、cccDNA、HBx等標(biāo)志物上的穩(wěn)定性與活性.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究的主要目標(biāo)是篩選并鑒定出能穩(wěn)定、高效表達(dá)cccDNA、HBx等標(biāo)志物的1.3-fold HBV全基因組HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型優(yōu)勢單克隆株,為“治愈”乙肝藥物的研制及HBV相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的探索奠定基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究以最佳MOI值將1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶細(xì)胞HepG2,以抗生素BSD最佳篩選劑量篩選出穩(wěn)定整合1.3-fold HBV基因的HepG2細(xì)胞系,1.3-fold HBV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,Sanger測序鑒定各候選陽性單克隆細(xì)胞的側(cè)翼序列對應(yīng)的基因組插入位置,ELISA法檢測HBsAg、HBeAg含量,PCR法檢測HBVDNA、cccDNA、HBx表達(dá)水平.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究成功篩選出1株能穩(wěn)定、高效地表達(dá)HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBx、cccDNA標(biāo)志物的優(yōu)勢單克隆株,命名為HepGA14,經(jīng)鑒定其入HepG2基因組位置為1:166461695-166461715.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究構(gòu)建并篩選出了1株能穩(wěn)定、高效表達(dá)HBV生物標(biāo)志物的優(yōu)勢單克隆株,將在乙肝“治愈”藥物的研制及肝硬化、肝癌、肝衰竭發(fā)病機(jī)制的研究上有較廣闊的應(yīng)用價(jià)值.

展望前景

本研究只觀察了連續(xù)培養(yǎng)20代范圍內(nèi)HepGA14的表達(dá)規(guī)律,對其長期傳代(＞100代)后的表達(dá)穩(wěn)定性及活性仍有待持續(xù)觀察.本項(xiàng)目組下一步,將對于1.3倍HBV基因組插入HepG2后對宿主本身的細(xì)胞形態(tài)、功能及活性的影響;對HepGA14轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物是否具有與體內(nèi)感染相一致的再感染性及致病功能;對干擾素、核苷(酸)類似物及中藥等抗病毒藥物的應(yīng)答敏感性等進(jìn)行深入研究,從而為實(shí)現(xiàn)攻克HBV做出積極貢獻(xiàn).