顏世卿 馬軻 陳巍

摘要：從雞腸中分離得到嚴(yán)格厭氧共生菌，篩選出適合禽類生產(chǎn)的益生菌株，探討其益生性，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。通過采集雞腸黏膜，特定厭氧培養(yǎng)基分離純化腸道厭氧共生菌。根據(jù)抑菌活性篩選得到口乳桿菌，隨后，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)基本特性分析，包括生長(zhǎng)曲線、酸耐受、膽鹽耐受、溶血性、細(xì)胞毒性分析等。結(jié)果顯示，口乳桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為24～60 h;對(duì)酸和膽鹽有優(yōu)良的耐受力;不具有多重耐藥性;不具有溶血活性;對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞系Raw264.7沒有細(xì)胞毒性;為后續(xù)微生態(tài)制劑以及抑菌物質(zhì)研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞腸道;口乳桿菌;分離鑒定;益生性

中圖分類號(hào)：S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2021）16-0157-05

動(dòng)物的腸道中存在著大量而多樣的微生物群體，我們將其稱為腸道菌群。在這些菌種中，包含大量乳酸菌（LAB），其中乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌為腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群。目前所分離得到的乳桿菌種大多來自人和動(dòng)物的胃腸道，其次是蔬菜及發(fā)酵產(chǎn)品[1]。乳酸菌是最重要的微生物之一，可用于食品發(fā)酵以及增強(qiáng)發(fā)酵食品的口感和質(zhì)感[2-3]。它們的主要特征是由葡萄糖作為原料生產(chǎn)乳酸、抑制細(xì)菌腐敗食品和病原體繁殖的生長(zhǎng)抑制物質(zhì)（如細(xì)菌素、過氧化氫、二?；龋4]。

在某些生產(chǎn)供人類食用的動(dòng)物的生產(chǎn)系統(tǒng)中，禁止使用許多抗生素，因此在這些系統(tǒng)中，益生菌的使用是重要的工具，不僅可以改善動(dòng)物健康狀況，減少疾病的發(fā)生率，而且可以提高生產(chǎn)率和食品質(zhì)量。LAB是動(dòng)物腸道菌群的一部分，對(duì)健康具有重要作用。實(shí)際上，已證明對(duì)動(dòng)物使用LAB可以改善健康狀況，提高疾病抵抗力并增強(qiáng)生長(zhǎng)和生殖性能[5]。

LAB在動(dòng)物生產(chǎn)中的用途已得到廣泛研究。在家禽生產(chǎn)中，乳酸菌素對(duì)生長(zhǎng)性能、禽體性狀、腸道菌群、血清生化成分、免疫參數(shù)和盲腸菌群以及明顯的回腸營(yíng)養(yǎng)消化率具有積極作用。由于某些LAB對(duì)病原菌具有抗菌作用，因此它們可以增加禽類對(duì)感染的抵抗力，防止不良影響并改善宿主健康。例如：已證明從雞的直腸樣本中提取的片球菌屬（Pediococcus sp.）對(duì)腸炎沙門氏菌和大腸桿菌具有抗菌活性[6]。

本試驗(yàn)從健康雞腸道中通過嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)分離口乳桿菌菌株，并評(píng)價(jià)其益生特性，以期為研發(fā)雞用微生態(tài)制劑、實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)在吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2019年9月至2021年4月。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌株與細(xì)胞

三黃雞購自長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，正常飼喂12～16周后用于試驗(yàn)。

本試驗(yàn)所使用的鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（ Escherichia coli）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系Raw264.7等菌株和細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑

瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白、葡萄糖，均購自O(shè)XOID公司;腦心浸出液肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、MRS肉湯，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;胎牛血清、綿羊血，均購自Gibco公司（美國(guó)）;細(xì)菌分離培養(yǎng)用維生素、微量鹽，均購自原葉生物有限公司;牛膽鹽、濃鹽酸溶液，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 雞腸共生菌分離培養(yǎng)基（YCFA）配制

BHI培養(yǎng)基18.5 g、酵母提取物5 g、TSB培養(yǎng)基15 g、葡萄糖0.5 g、磷酸氫二鉀2.5 g、氯化鈀0.33 g、黏蛋白4 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂，115 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至45 ℃繼續(xù)加入5%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、維生素K3 5 μg、氯化血紅素10 μg、微量鹽1 mL、D-生物素10 μg、維生素B12 10 μg、吡多胺（維生素B6）100 μg、葉酸（維生素B9）50 μg、L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物0.6 g即得。

1.4 雞腸源共生菌分離培養(yǎng)

提前準(zhǔn)備YCFA瓊脂和液體培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)箱中平衡24 h;將適齡三黃雞采用急性失血法處死后，剖開腹腔，暴露腸道，用止血鉗夾住所需盲腸兩端，用手術(shù)剪沿止血鉗外端剪開，拿出腸段;超凈臺(tái)中，用手術(shù)剪剪開盲腸，暴露腸內(nèi)容物，用手術(shù)刀輕柔刮去腸內(nèi)容物，換刀繼續(xù)刮取腸黏膜，PBS倍比稀釋后，平板劃線于YCFA瓊脂平板;37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落至YCFA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)平板劃線，直至整個(gè)平板菌落單一。

1.5 分離菌株的鑒定

選取菌落單一的菌株，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌液送往吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，所得序列通過NCBI BLAST，同GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌株種屬。

1.6 抑菌活性菌株的檢測(cè)

將培養(yǎng)48 h的共生菌擴(kuò)增菌液8 000 r/min，4 ℃ 離心10 min，上清用0.22 μm濾膜過濾得到無細(xì)胞發(fā)酵液，將培養(yǎng)好的指示菌鼠傷寒沙門菌按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種至相應(yīng)40 ℃高壓滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基中，輕柔并迅速混合均勻后倒板，待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，在表面放置牛津杯，每個(gè)牛津杯內(nèi)加入 200 μL 上述無細(xì)胞發(fā)酵液，在生物潔凈工作臺(tái)中擴(kuò)散3 h后，37 ℃培養(yǎng)9 h，檢測(cè)是否有抑菌圈出現(xiàn)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 口乳桿菌抑菌活性檢測(cè)

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)口乳桿菌Y62的抑菌活性。首先將10 mL 2%瓊脂傾倒在滅菌平板上，待其凝固后，加入含有100 μL指示菌懸液的相應(yīng)指示菌瓊脂培養(yǎng)基10 mL，待凝固后，以無菌操作在培養(yǎng)基表面垂直加入牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入Y62的CFS 200 μL，每組重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)12～18 h。測(cè)定抑菌圈直徑。

1.8 口乳桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

提前準(zhǔn)備MRS培養(yǎng)基和平板，置于厭氧培養(yǎng)箱中平衡24 h，并測(cè)定MRS培養(yǎng)基pH值;挑取MRS瓊脂上的口乳桿菌Y62單菌落于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃ 厭氧培養(yǎng)48 h;調(diào)節(jié)菌液濃度至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（D600 nm為0.8～1.2）;將菌液按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至預(yù)平衡的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng);每 12 h 吸取1 mL菌液，檢測(cè)其D600 nm并涂布平板;根據(jù)D600 nm值和平板菌落計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.9 口乳桿菌的酸耐受、膽鹽耐受檢測(cè)

用1 mol/L鹽酸將MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)至2、3、4、5、6;另向MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%和0.3%的牛膽鹽;將Y62菌株活化2代后，以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;離心收集細(xì)菌;將Y62調(diào)整至所需濃度，將菌體重新懸浮于不同pH值以及含牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h;采用平板涂布法計(jì)算在不同條件MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 h和3 h的活菌數(shù)量，試驗(yàn)重復(fù)3次;存活率計(jì)算：存活率=N1/N0×100%，式中：N1表示3 h測(cè)定的活菌數(shù)，lg CFU/mL;N0表示0 h測(cè)定的活菌數(shù)，lg CFU/mL[7]。

1.10 口乳桿菌的藥物敏感性檢測(cè)

提前準(zhǔn)備MRS培養(yǎng)基和平板，置于厭氧培養(yǎng)箱中平衡24 h;取保藏的Y62菌株，活化2代后接種至MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;離心收集細(xì)菌;將Y62調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛龋?0 μL 涂布平板;夾取藥敏紙片平放在含菌平板上，每個(gè)平板放置6種藥敏片;37 ℃厭氧培養(yǎng)16～24 h;質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300_TCH1516;觀察并測(cè)量Y62抑菌圈直徑，并參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute）推薦的紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.11 口乳桿菌的溶血性檢測(cè)

配制100 mL BHI瓊脂，加入7 mL新鮮滅菌綿羊血，倒板，4 ℃保存?zhèn)溆?向血平板上滴加10 μL濃度為108 CFU/mL的口乳桿菌Y62，對(duì)照組滴加10 μL相同濃度的金黃色葡萄球菌;37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h;觀察血平板，接種物周圍的半透明光環(huán)表明存在溶血活性。

1.12 口乳桿菌的細(xì)胞毒性檢測(cè)

取保存的Raw264.7細(xì)胞傳代3次后消化，按 1×105 cell/well接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，正常培養(yǎng)12 h;輕柔吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，加入不含雙抗的DMEM 90 μL，再加入調(diào)整好濃度的Y62菌液10 μL，對(duì)照組加入10 μL MRS液體培養(yǎng)基;4 ℃、1 000 r/min水平離心2 min，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);6、24 h對(duì)細(xì)胞通過CCK-8試劑盒檢測(cè)存活率。

1.13 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0分析軟件，并采用Multiple t test對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

本試驗(yàn)共分離培養(yǎng)共生菌菌株41株，分屬于乳桿菌屬、腸球菌屬、螺桿菌屬、普雷沃菌屬、芽孢桿菌屬等5個(gè)屬11個(gè)種，具體種類見表1。

2.2 抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

分離菌株的抑菌活性檢測(cè)如圖1所示，共有5株共生菌對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌活性，其中Y62抑菌活性最好，抑菌圈直徑達(dá)20.7 mm，因此選擇Y62作為候選菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 口乳桿菌Y62抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

由圖2可見，口乳桿菌Y62對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌以及單增李斯特菌均具有一定的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性。

2.4 口乳桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

根據(jù)口乳桿菌Y62的生長(zhǎng)曲線（圖3）顯示，該菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為6～24 h;穩(wěn)定期為24～60 h;60 h 后進(jìn)入衰亡期。

2.5 口乳桿菌的酸耐受、膽鹽耐受結(jié)果

口乳桿菌Y62的酸耐受結(jié)果見表2，菌株在pH值≥3環(huán)境內(nèi)3 h后存活率均大于95%，在pH值=2環(huán)境內(nèi)3 h存活率為69.8%。膽鹽耐受結(jié)果如表3所示。

2.6 口乳桿菌的藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)所用質(zhì)控菌株所產(chǎn)抑菌圈直徑在質(zhì)控范圍內(nèi)，證明本試驗(yàn)所用藥品合格，口乳桿菌Y62對(duì)不同抗生素的耐藥性結(jié)果見表4?？谌闂U菌Y62對(duì)所檢測(cè)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（紅霉素、麥迪霉素）表現(xiàn)出100%的敏感率，對(duì)喹諾酮類抗生素（氧氟沙星、環(huán)丙沙星）表現(xiàn)出100%的敏感率，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢類）表現(xiàn)出78%的敏感率，對(duì)氨基糖苷類抗生素（慶大霉素、卡那霉素）表現(xiàn)出耐藥。

2.7 口乳桿菌的溶血性檢測(cè)結(jié)果溶血結(jié)果

由圖4可見，陽性對(duì)照顯示溶血性，口乳桿菌Y62不具有溶血活性。

2.8 口乳桿菌的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞毒性檢測(cè)如圖5所示，口乳桿菌Y62在MOI=100時(shí)作用24 h，細(xì)胞無死亡，與培養(yǎng)基對(duì)照組無差異，證明其不具有細(xì)胞毒性。

3 討論

本試驗(yàn)的目的在于分離來自雞腸道的共生菌，并找尋其中潛在的抑菌益生菌。健康禽類腸道分布著超過300種細(xì)菌，其中約有半數(shù)為厭氧或兼性厭氧菌，對(duì)這些細(xì)菌的分離鑒定具有較為重要的意義。乳酸菌是腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群 本次試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)，本次分離的41株共生菌中，乳酸菌共有31株，占比75.61%，而這些乳酸菌中，乳桿菌28株，占比90.32%，其中口乳桿菌僅1株。作為雞腸道中的主要乳桿菌種，本次僅分離出1株，其一可能是由于口乳桿菌主要分布在十二指腸、空腸區(qū)域，在盲腸的含量較低[8]。其二可能是在分離純化過程中，菌群的多樣性發(fā)生了變化，部分共生菌無法分離得到活菌。通過本研究分離得到的口乳桿菌，表明本研究所采取的以盲腸黏膜為來源，對(duì)不易培養(yǎng)共生菌進(jìn)行分離純化的方法和路線是有效的，在有限的條件下可以進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

口乳桿菌Y62作為雞腸道共生菌，其定植的必要條件是耐受胃腸環(huán)境，本研究的結(jié)果也證實(shí)這點(diǎn)。該菌對(duì)酸有較強(qiáng)耐受能力，在pH值=3的條件下培養(yǎng)3 h，存活率幾乎等于100%，在pH值=2條件下培養(yǎng)3 h，存活率依然高于70%，但是其對(duì)膽鹽的耐受能力較弱，在0.3%膽鹽濃度下，存活率為70.3%，低于其他乳酸桿菌，這可能是不同種屬間具有差異性導(dǎo)致，與先前的研究[9]相符合。

從雞腸道中分離得到的共生菌，為了后續(xù)培養(yǎng)以及益生性評(píng)價(jià)，對(duì)其耐藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)是十分必要的。本試驗(yàn)中口乳桿菌Y62對(duì)市面上的大部分抗生素均敏感，僅對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)耐藥，無多重耐藥性。并且有研究表明，乳酸菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥性表現(xiàn)出較大屬間差異，乳球菌屬、鏈球菌屬等對(duì)其無耐藥性，乳桿菌屬對(duì)其表現(xiàn)出較高的耐藥性[10]，本試驗(yàn)的結(jié)果與之相符合。

腸道共生菌群除益生菌外，還有條件致病菌和致病菌，所以對(duì)口乳桿菌Y62的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)非常重要。因?yàn)榭谌闂U菌Y62是從健康雞的腸道中分離，故安全性評(píng)價(jià)并未進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了它的安全性，對(duì)于未來在食品、醫(yī)藥或畜牧行業(yè)的應(yīng)用是安全的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離得到的嚴(yán)格厭氧口乳桿菌具有優(yōu)良益生菌的益生特性，作為雞源益生菌具有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]de Vuyst L，Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria：production，purification，and food applications[J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2007，13（4）：194-199.

[2]van Geel-Schutten G H，F(xiàn)lesch F，ten Brink B，et al. Screening and characterization of Lactobacillus strains producing large amounts of exopolysaccharides[J]. Applied Microbiology&Biotechnology，50（6）：697-703.

[3]Hati S，Mandal S，Prajapati J B. Novel starters for value added fermented dairy products[J]. Current Research in Nutrition and Food Science Journal，2013，1（1）：83-91.

[4]Alakomi H L，Skytt E，Saarela M，et al. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（5）：2001-2005.

[5]Yeoman C J，White B A. Gastrointestinal tract microbiota and probiotics in production animals[J]. Annual Review of Animal Biosciences，2014，2：469-486.

[6]Noohi N，Ebrahimipour G，Rohani M，et al. Evaluation of potential probiotic characteristics and antibacterial effects of strains of Pediococcus species isolated from broiler chickens[J]. British Poultry Science，2016，57（3）：317-323.

[7]石春衛(wèi)，謝 靜，楊桂連，等. 豬源糞腸球菌的分離與鑒定[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（9）：123-127.

[8]Wang L，F(xiàn)ang M J，Hu Y P，et al. Characterization of the most abundant Lactobacillus species in chicken gastrointestinal tract and potential use as probiotics for genetic engineering[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2014，46（7）：612-619.

[9]Liong M T，Shah N P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains[J]. Journal of Dairy Science，2005，88（1）：55-66.

[10]Gad G F M，Abdel A M，F(xiàn)arag Z S H. Antibiotic resistance in lactic acid bacteria isolated from some pharmaceutical and dairy products[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2014，45（1）：25-33.