趙辰 廖軍義 肖鵬程 黃偉

摘要：目的：探討B(tài)MP9與Relaxin在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的協(xié)同作用。方法：以小鼠脂肪來(lái)源永生化間充質(zhì)干細(xì)胞iMads作為誘導(dǎo)細(xì)胞，用采用腺病毒方式實(shí)現(xiàn)Relaxin與BMP9共表達(dá)，采用堿性磷酸酶，鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)及PCR等方式觀察Relaxin對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。結(jié)果：Relaxin增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的堿性磷酸酶Alkaline phosphatase（ALP）活性的增加，獲取更多鈣鹽沉積。Realtime PCR提示成骨相關(guān)因子Runx2及Osx表達(dá)明顯增加，同時(shí)PPAR-γ表達(dá)也明顯下降，但并沒(méi)有促進(jìn)骨橋蛋白的表達(dá)。結(jié)論：Relaxin可協(xié)同BMP9介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

關(guān)鍵詞：Relaxin ;BMP9;成骨誘導(dǎo);

Objective： To investigate the synergistic effects of bone morphogenetic protein 9 （BMP9） and Relaxin on inducing osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.Methods： Immunized mouse adipocyte derived mesenchymal stem cells （IMADs） were used as seed cells. Adenovirus was used to co-express Relaxin and BMP9. The effects of Relaxin on osteogenic differentiation of BMP9-induced mesenchymal stem cells were investigated by alkaline phosphatase assay， calcium salt deposition assay and PCR in vitro and ectopic bone formation on null mice in vivo.Results： Relaxin enhanced the BMP9-induced ALP activity and resulted in increased calcium salt deposition. Realtime PCR test indicated that the expressions of osteogenic factors Runx2 and OSX were significantly increased but not OPN. Relaxin also enhance BMP9-induced ectopic bone formation with less adipogenic differentiation .Conclusion： Relaxin may collaborate with BMP9-mediated osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

Keywords： Relaxin; BMP9; osteogenic induction;

背景：

骨缺損是當(dāng)前臨床面臨的重要挑戰(zhàn)[1]。采用成骨誘導(dǎo)因子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)以獲取具有生理活性的生物工程骨是目前研究的熱點(diǎn)[2]。在 BMP家族（bone morphogenetic protein family）成員中，BMP9被證明具有最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)能力，在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的成骨能力。研究表明BMP9可誘導(dǎo)多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化表達(dá)成骨因子 [3]。雖然BMP9具有較強(qiáng)的成骨能力，但在生物工程骨構(gòu)建方面仍存在著誘導(dǎo)能力不足的問(wèn)題。通過(guò)多分子組合獲取成骨最大化具有相當(dāng)?shù)默F(xiàn)實(shí)意義。

Relaxin （Rln）是結(jié)構(gòu)相關(guān)激素胰島素/Rln家族的成員，可通過(guò)激活 Rxfps膜受體發(fā)揮自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌作用。最近，Rln受體不僅在生殖組織中被發(fā)現(xiàn)，而且在骨骼組織包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞也存在表達(dá)，這提示Rln可能在骨生長(zhǎng)發(fā)育中具有生理意義[4]。然而Relaxin在間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和體內(nèi)骨形成的作用仍然未知。Moon等人在JMBR的研究發(fā)現(xiàn)BMP2所誘導(dǎo)的成骨作用可以被Relaxin表達(dá)增強(qiáng)，初步證明了Rln在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用[5]。

以上證據(jù)提示Relaxin可能參與BMPs誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。BMP9作為最強(qiáng)的BMPs成員，能否在Rln的協(xié)同下獲取更強(qiáng)的成骨能力，是一個(gè)頗具吸引力的課題。本研究通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染方式在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)獲取BMP9與Relaxin高表達(dá)，以探究Relaxin對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.2 主要試劑與材料

采用小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株（C3H10T1/2）以及人胚腎293細(xì)胞株（HEK293），重組腺病毒Ad-BMP9、Ad-Relaxin，對(duì)照重組腺病毒Ad-GFP均由美國(guó)芝加哥大學(xué)分子腫瘤研究室主任何通川教授惠贈(zèng)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自Bionid公司，而DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)自HyClone公司，青鏈霉素等均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Real-time PCR引物皆由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 iMADs細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

iMADs細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入適量Ad-GFP、Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin 病毒。感染之后的24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2堿性磷酸酶染色

堿性磷酸酶（ALP）測(cè)定使用改良的Great Escape SEAP化學(xué)發(fā)光法（BD Clontech）在腺病毒感染后5和7天評(píng)估早期成骨標(biāo)志物ALP活性。

1.3.3鈣鹽沉積染色

將iMAD細(xì)胞接種于24孔板并感染腺病毒。感染細(xì)胞在抗壞血酸（50 mg/ml）和β-甘油磷酸鹽（10 mM）存在下培養(yǎng)。感染后第7天，使用茜素紅S染色法對(duì)礦化基質(zhì)結(jié)節(jié)進(jìn)行鈣沉淀染色.

1.3.4 Real-time PCR

按1.3.2的方法在6 孔板中培養(yǎng)iMADs 細(xì)胞，分別于第5天提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-time PCR，檢測(cè)，Runx2，OPN，PPAR-γ與Osx相對(duì)表達(dá)水平。GAPDH做內(nèi)參，每次反應(yīng)設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔和無(wú)模板陽(yáng)性對(duì)照（NTC），NTC未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以x±s表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較t檢驗(yàn)。

結(jié)果：

2.1 重組病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞后目的基因表達(dá)

感染24 h后，Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin及Ad-GFP感染C3H10T1/2的感染率達(dá)40%～50%，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)明顯凋亡征象 （圖 1），熒光檢查證明感染有效，BMP9與Relaxin可在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)（圖1）。

2.2 Relaxin協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs體外成骨分化、

當(dāng)iMADs細(xì)胞與AdBMP9/Rln共轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，第5天就顯著增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的早期成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）活性， Rln共表達(dá)顯著增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的體外基質(zhì)礦化，而Rln并不具有單獨(dú)誘導(dǎo)礦化的能力（圖2B）。

2.3 Relaxin協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化時(shí)mRNA的表達(dá)變化

重組腺病毒感染iMADs后，提取第5天樣本中mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在BMP9組與BMP9+Rln組中，成骨因子水平均明顯高于同時(shí)間點(diǎn) GFP組（P<0.05）。高表達(dá)Rln促進(jìn)了成骨早期Runx2和中期Osx mRNA的表達(dá)（P<0.05）。成脂分化標(biāo)志因子 PPAR-γ的表達(dá)也明顯受抑制（圖3）。

討論：

BMPs家庭是備受關(guān)注的一類成骨誘導(dǎo)因子，BMP9證明具有強(qiáng)大的成骨能力。然而，BMP9介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的效率仍離臨床要求存在較大距離，通過(guò)分子組合的方式獲得更佳的骨形成是目前的研究方向。

Rln，稱為妊娠激素，在妊娠期間起到了軟化宮頸的作用.Rln受體不僅在生殖組織中被發(fā)現(xiàn)，而且在骨骼組織包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了Rln受體的存在[6]。這提示RLN也可能在骨骼系統(tǒng)中具有重要作用。JMBR文章報(bào)道，鼠骨髓干細(xì)胞（BMSCS）在骨形態(tài)發(fā)生蛋白2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用可被BMP2顯著增強(qiáng)。Rln對(duì)于BMP9這一最強(qiáng)大的BMPs成員的作用仍不清楚。

通過(guò)Rln與BMP9共表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)，Rln表達(dá)可顯著增強(qiáng)BMP9介導(dǎo)的成骨分化，提高了ALP活性的同時(shí)獲得了更高的鈣鹽沉積率。而通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，Relaxin顯著的上調(diào)了BMP9介導(dǎo)的Osx與Runx2表達(dá)，ALP染色提示堿性磷酸酶的表達(dá)也明顯加強(qiáng)。而相對(duì)的OPN的表達(dá)未見明顯的升高，這提示Rln可能通過(guò)早期增強(qiáng)成骨分化達(dá)到增強(qiáng)成骨的作用的。但值得注意的是，RLN本身不具備成骨誘導(dǎo)能力。同時(shí)Rln對(duì)成骨分化的調(diào)控具有階段性，其更可能在成骨分化早期起到促進(jìn)成骨的作用。相對(duì)應(yīng)的，我們發(fā)現(xiàn)PPAR-γ的表達(dá)在Rln表達(dá)下明顯受抑制，這提示Rln可能通過(guò)抑制BMP9介導(dǎo)的脂肪分化達(dá)到增強(qiáng)成骨的作用[7]。

綜上所述，本研究初步探明了Rln增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)成骨的作用，其作用可能通過(guò)上調(diào)Runx2與Osx等前中期成骨因子表達(dá)而抑制脂肪化標(biāo)志因子的表達(dá)，提示Relaxin可能推動(dòng)成骨早期分化，這提示Relaxin可能通過(guò)抑制脂肪化達(dá)到增強(qiáng)成骨作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Rln對(duì)BMP9成骨的誘導(dǎo)作用。然而由于Rln依賴于多個(gè)受體進(jìn)行調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制的多樣性與復(fù)雜性，不同表達(dá)水平的Rln對(duì)在成骨分化中的作用尚待研究。

參考文獻(xiàn)：

1.Tatara AM， Mikos AG： Tissue Engineering in Orthopaedics. J Bone Joint Surg Am 2016;98：1132-1139

2. Bara JJ， Herrmann M， Evans CH， Miclau T， Ratcliffe A， Richards RG： Improving translation success of cellbased therapies in orthopaedics. J Orthop Res 2016;34：17-21

3. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， Kong Y， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

4. Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin on extracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103. 37. Silvertown JD， Summerlee AJ， Klonisch T. Relaxin‐like peptides in cancer. Int J Cancer. 2003;107（4）：513–9.

5. Jung Sun Moon， SunHun Kim et al Relaxin Augments BMP2–Induced OsteoblastDifferentiation and Bone Formation. Journal of Bone and Mineral Research， Vol. 29， No. 7， July 2014， pp 1586–1596

6.Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin onextracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103.

7. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， KongY， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院?重慶?400030