竇仁剛 吳婷婷 洪永鋒

摘要：目的 探究氯諾昔康誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的表達(dá)效果。方法 取SD雄性小鼠后肢骨髓細(xì)胞，采用密度梯度離心全骨髓貼壁法分離、純化、培養(yǎng)出骨髓干細(xì)胞，然后用Giemsa染色細(xì)胞在顯微鏡下觀察不同階段細(xì)胞形狀特征，使用茜素紅染色及ALP染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成與沉淀情況，并通過(guò)PCR檢測(cè)三個(gè)成骨基因（BMP2、OCN 和 Runx2）的表達(dá)效果。結(jié)果 與對(duì)照組相比，加藥組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量更多（均P<0.05），且加藥組的三個(gè)成骨基因（BMP2、OCN 和 Runx2）表達(dá)水平更高（均<0.05），表明氯諾昔康具有促進(jìn)BMSCs向成骨分化的作用。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定濃度的氯諾昔康誘導(dǎo)下，向成骨方向分化。

關(guān)鍵詞：氯諾昔康?骨質(zhì)疏松?骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞?成骨分化

1.引言

氯諾昔康是一種新型較低的親脂性非甾體抗炎藥，其具有系統(tǒng)性的鎮(zhèn)痛、解熱和抗炎作用，因?yàn)樗种骗h(huán)氧合酶的作用并因此阻止了前列腺素的生物合成[1]。有研究發(fā)現(xiàn)氯諾昔康不但對(duì)老年患者關(guān)節(jié)置換術(shù)后康復(fù)鎮(zhèn)痛有顯著效果，而且也有相關(guān)參考文獻(xiàn)提示在鎮(zhèn)痛的同時(shí)有促進(jìn)成骨形成的作用[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一類(lèi)具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，能夠向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分化[3-4]。本研究利用氯諾昔康誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，為更多骨質(zhì)流失疾病治療方法提供理論研究依據(jù)，發(fā)展新思路。

2 材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

選用SPF級(jí)健康的雄性SD鼠后肢骨髓腔提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，小鼠體重為（100 ±10）g。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氯諾昔康，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，青霉素，鏈霉素，成骨誘導(dǎo)試劑，PCR相關(guān)試劑盒及成骨抗體，茜素紅染色試劑盒

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外提純和培養(yǎng)

選用4周齡的雄性SD小鼠，通過(guò)快速脫頸法安樂(lè)死SD小鼠，在無(wú)菌操作條件下取小鼠的雙側(cè)后肢骨髓，用培養(yǎng)基沖洗，直至沖凈為止。然后離心后，使用含有10% FBS基礎(chǔ)液反復(fù)吹打重懸的細(xì)胞以制備單細(xì)胞懸掛。計(jì)數(shù)后，將單細(xì)胞懸液以1×106個(gè)/mL的密度接種到25 cm2的培養(yǎng)皿中，在5% CO2恒溫箱中于37°C培養(yǎng)。3天后，對(duì)半更換營(yíng)養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞后，當(dāng)鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)超過(guò)容量的80%聚集融合度時(shí)，行進(jìn)一步傳代，傳至P3代用于實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 氯諾昔康誘導(dǎo)細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

選用P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按密度為 5×105個(gè)/mL鋪種于培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)，選用不同濃度的氯諾昔康誘導(dǎo)21天，同時(shí)用不誘導(dǎo)細(xì)胞作為對(duì)照組。然后對(duì)其行PCR成骨基因檢測(cè)和相關(guān)染色，將實(shí)驗(yàn)分為5組，（-）組（正常培養(yǎng)基）、（+）組（含成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)基）和加藥組（含成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)基+氯諾昔康），其中加藥組又包含三組不同氯諾昔康濃度組，即10-5 mmol/L組、10-6 mmol/L組和10-7 mmol/L組。

2.3.3 PCR檢測(cè)特異性成骨基因表達(dá)水平

誘導(dǎo)21天收集細(xì)胞，用Trizol 裂解液、氯仿溶液、異丙醇按步驟進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，然后對(duì)RNA濃度和純度的OD值進(jìn)行測(cè)定，測(cè)完值行逆轉(zhuǎn)錄，引物配制及聚合酶鏈反應(yīng)，最后依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所得的Ct值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用 2-ΔΔCt法分析，對(duì)各組mRNA 結(jié)果進(jìn)行作圖比較。

2.3.4 細(xì)胞染色

誘導(dǎo)21天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，然后用Giemsa染色液，茜素紅染色液避光下孵育0.5h-12h，然后PBS緩慢沖洗后，鏡下拍照。

2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），通過(guò)方差的單向或雙向進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比結(jié)果以p<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該實(shí)驗(yàn)中所有結(jié)果均獨(dú)立重復(fù)至少3次。

3 結(jié)果

3.1 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)分散貼壁生長(zhǎng)，大小不一，紡錘形細(xì)胞，像菌落一樣聚集生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，見(jiàn)圖1。

3.2 成骨相關(guān)mRNA在不同濃度氯諾昔康組中的表達(dá)

不同濃度（10-5 mmol/L、10-6 mmol/L和10-7 mmol/L）氯諾昔康與BMSCs共培養(yǎng)21天后，對(duì)各組成骨基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行比較。如圖2所示，與（-）組相比，（+）組三種成骨基因的mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P< 0.05）;與（+）組相比，三個(gè)濃度梯度氯諾昔康組三種mRNA表達(dá)水平呈增高態(tài)勢(shì);不同濃度組組間比較，其中10-6 mmol/L濃度組表達(dá)最明顯。

3.3 茜素紅染色

為了驗(yàn)證PCR成骨基因表達(dá)結(jié)果，進(jìn)一步行細(xì)胞成骨染色，共培21天后，觀察不同組別茜素紅染色結(jié)果，如圖3所示，結(jié)果可見(jiàn)，與（-）組相比，（+）組鈣結(jié)節(jié)表達(dá)水平較高（p<0.05）;不同濃度的氯諾昔康組組間比較，其中10-6 mmol/L濃度組鈣結(jié)節(jié)表達(dá)量最多（p< 0.05），與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

4 討論

氯諾昔康作為新型NSAIDs可主要通過(guò)抑制環(huán)氧化酶活性而降低前列腺素合成， 調(diào)節(jié)內(nèi)啡肽等物質(zhì)分泌， 實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛效果[5]。研究發(fā)現(xiàn)在某種情況下在鎮(zhèn)痛同時(shí)具有促進(jìn)成骨作用，具體機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。

本研究利用氯諾昔康的特殊作用方式，根據(jù)干細(xì)胞具有多向分化性，通過(guò)體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨是可行的[6]。首先用氯諾昔康進(jìn)行誘導(dǎo)干細(xì)胞21天，檢測(cè)相關(guān)成骨基因表達(dá)效果，然后行茜素紅染色，結(jié)果顯示經(jīng)氯諾昔康誘導(dǎo)21天后，成骨相關(guān)標(biāo)基因的表達(dá)及成骨染色結(jié)果效果顯著。由此可見(jiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在氯諾昔康的誘導(dǎo)下，向成骨方向分化。

5參考文獻(xiàn)

[1]Helmy HS， El-Sahar AE， Sayed RH， et al.Therapeutic effects of lorno xicam -loaded nanomicellar formula in experimental models of rheumatoid arthritis[J].Int J Nanomedicine， 2017， 12： 7015-7023.

[2]楊云麗， 魏輝明， 張承華， 等.氯諾昔康對(duì)老年患者全髖置換術(shù)后舒芬太尼皮下自控鎮(zhèn)痛效果的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2014， 19（02）： 190-195.

[3]Wang B， Wen H， Smith W， et al.Regulation effects of melatonin on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation.J Cell Physiol， 2019， 234（2）： 1008-1015.

[4]顧珊，趙高平， 李 喜.小分子化合物誘導(dǎo)細(xì)胞重編程研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)， 2018， 34（1）： 79-83

[5]鄭鎮(zhèn)偉， 王忱， 吳濤.氯諾昔康對(duì)大鼠神經(jīng)性疼痛發(fā)生過(guò)程中背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)GAP-43和NGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)師雜志， 2013， 15 （6）： 767-771.

[6]Akbulut AC， Wasilewski GB， Rapp N， et al.Menaquinone-7 Supplementation Improves Osteogenesis in Pluripotent Stem Cell Derived Mesenchymal Stem Cells[J].Front Cell Dev Biol， 2020， 8： 618760.

基金項(xiàng)目：T 細(xì)胞介導(dǎo)的微環(huán)境促進(jìn)干細(xì)胞在骨組織工程中應(yīng)用研究，編號(hào)：81600845。

第一作者：竇仁剛，男，安徽六安人，在讀碩士研究生。

通訊作者：洪永鋒，男，安徽黃山人，博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：hy_feng@ 163.com

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科?安徽合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科?安徽合肥?230031）