艾安濤 張寶會 彭徐乾 呂立堂

摘要：WOX轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應中起著重要的調(diào)控作用。文章基于全基因組數(shù)據(jù)，從茶樹基因組中鑒定出29個WOX基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、保守域、染色體定位進行分析，同時分析了它們在PEG誘導的干旱脅迫、鹽脅迫處理中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，29個CsWOX（茶樹WOX）基因在茶樹染色體上分布不均;根據(jù)進化關(guān)系將茶樹WOX基因分為4類;基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)相同亞家族的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域基本一致;基因表達分析顯示，CsWOX基因在花和果實組織中具有較高的表達水平，且部分基因隨著葉片成熟度的增加，表達水平升高;不同的CsWOX基因在PEG誘導的干旱脅迫、鹽脅迫處理下存在差異表達，說明CsWOX基因廣泛參與茶樹生長發(fā)育并在響應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。該結(jié)果將為進一步研究WOX基因在調(diào)控茶樹生長發(fā)育和非生物脅迫響應中的作用提供一些有價值的信息，為茶樹WOX基因的功能研究與利用提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶樹;WOX基因家族;轉(zhuǎn)錄因子;基因表達分析

Identification and Expression Pattern Analysis of

WOX Gene Family in Camellia sinensis （L.）

AI Antao1， ZHANG Baohui2， PENG Xuqian1， L? ? Litang1，2*

1. College of Tea Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Institute of Agro-Bioengineering， Guizhou

University College of Life Sciences， Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm

Innovation in Mountainous Regions， Ministry of Education， Guiyang 550025， China

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Abstract： WOX transcription factors play an important regulatory role in plant growth， development and response toabiotic stresses. Based on the tea whole genome data， this study identified 29 WOX genes and analyzed their genestructures， evolutionary relationship， conserved domains， and chromosome locations. Meanwhile， their responses to?drought stress and salt stress induced by PEG were studied. The results show that 29 CsWOX genes were unevenlydistributed on tea plant chromosomes. They were classified into category IV according to evolutionary relationship.?Their gene structures and conserved domains of the same subfamily were basically the same. Gene expression analysisshows that the CsWOX genes had higher expression levels in flower and fruit tissues， and the expressions of somegenes increased with the increase of leaf maturity. CsWOX genes exhibited different expression patterns underPEG-induced drought stress and salt stress， indicating that CsWOX genes are widely involved in tea plant growth anddevelopment and play different roles in response to abiotic stress. This result will provide some valuable informationfor further research on the role of WOX gene in regulating the growth and development of tea plants and response toabiotic stresses. It also provided a scientific basis for the functional research and utilization of tea plant WOX genes.

Keywords： Camellia sinensis （L.）， WOX gene family， genome identification， gene expression analysis

WOX蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其名稱源于一段由約60個氨基酸組成的高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋-拐角-螺旋結(jié)構(gòu)域，此外，在WUS組或者I組的WOX蛋白氨基酸C端還存在一個高度保守的基序，命名為WUS-box （TLXLTP），該基序在WOX蛋白調(diào)控植物生長發(fā)育進程中起重要的作用[1]。

近幾年，研究者通過正向遺傳和反向遺傳方法對不同植物的研究表明，WOX轉(zhuǎn)錄因子對植物的生長發(fā)育、干細胞穩(wěn)態(tài)維持、抗逆性、初生和次生物質(zhì)代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導等有重要的調(diào)控作用，如柳枝稷WOX轉(zhuǎn)錄因子STF基因通過直接抑制下游細胞分裂素氧化酶相關(guān)基因的表達，增加了轉(zhuǎn)基因水稻葉片生物量和糖的含量[2];WOX11通過抑制RR2基因的表達，調(diào)控水稻冠根的生長發(fā)育，在水稻中提高WOX11的表達增加了冠根的數(shù)目和生長速度，相反，降低該基因的表達導致冠根數(shù)目和生長速度降低[3]，并且WOX11基因通過調(diào)控水稻根的發(fā)育，增加了轉(zhuǎn)基因水稻對干旱脅迫的抗性[4];擬南芥WOX5功能缺失突變體促進干細胞分化，反之，WOX5超表達降低了干細胞的分化，該結(jié)果表明，WOX5在維持擬南芥干細胞穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[5];擬南芥WOX13通過抑制JAGGED基因（該基因編碼一個包含鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，參與擬南芥外側(cè)器官形態(tài)發(fā)生的調(diào)控）的表達，促進擬南芥果實胎座框（Replum）的形成[6]。以上研究結(jié)果表明，WOX轉(zhuǎn)錄因子主要通過改變下游基因的表達，影響植物生長發(fā)育進程。

基于WOX蛋白全長氨基酸序列的相似性和拓撲結(jié)構(gòu)，擬南芥WOX基因家族蛋白被分成3個組，即組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[1]。目前，隨著全基因組學和轉(zhuǎn)錄組學測序技術(shù)的發(fā)展，許多物種WOX轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定和分析，如擬南芥、水稻、桑樹、陸地棉等[7-8]。值得注意的是，關(guān)于WOX蛋白的克隆和功能研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物中，在茶樹中未有報道。

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，良好的生態(tài)環(huán)境是茶樹正常生長、茶葉品質(zhì)形成的主要影響因素，然而，茶樹生長過程中不可避免受到干旱、低溫等多種逆境脅迫，極大地影響了茶園產(chǎn)量。目前，對茶樹WOX家族基因的研究報道較少，關(guān)于茶樹WOX家族基因逆境相關(guān)的研究更是很少有報道。

本試驗采用生物信息學等方法，對茶樹WOX家族基因進行了基因組鑒定，并用鑒定到的茶樹、擬南芥以及水稻W(wǎng)OX基因構(gòu)建了進化樹，并進一步對其基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、染色體分布、啟動子順式作用元件以及逆境下的表達模式進行分析，能夠獲得對茶樹WOX家族基因特性更多的了解，為茶樹WOX家族基因機制和抗逆響應中的功能奠定基礎。

一、材料與方法

1. 茶樹WOX基因家族的篩選與分析

從茶樹的全基因組數(shù)據(jù)庫（http：//tpia.teaplant.org）和擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org）中下載兩者的全基因組數(shù)據(jù)、啟動子序列、染色體定位、DNA、CDS信息等。首先從 Pfam （http：//pfam.xfam.org）中下載WOX基因特有的保守結(jié)構(gòu)域模型（PF00046），利用該模型在茶樹蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，設定閾值為E<1e-5 ，獲得假設的茶樹WOX基因，接著利用第一次鑒定到的假設茶樹WOX基因序列重新構(gòu)建關(guān)于茶樹的WOX基因隱馬爾可夫模型，進行第二次搜索鑒定，又一次獲得假設的茶樹WOX基因。將第二次獲得的茶樹假設WOX基因蛋白序列提交至NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi，http：//smart.embl-heidelberg.de）以及Pfam（http：//pfam.xfam.org）進行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，剔除冗余序列，最終得到茶樹WOX基因。利用HMM 3.0軟件中的perl腳本對茶樹WOX蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點、氨基酸長度和染色體位置進行分析。

2. 系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件對茶樹、擬南芥和水稻的WOX蛋白序列進行多序列比對，比對結(jié)果利用MEGA X軟件進行臨近法（Neighbor joining， NJ）分析，Boostrap參數(shù)設為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將CsWOX基因組DNA序列和CDS序列提交至GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進行基因結(jié)構(gòu)分析，利用MEME（http：//meme-suite.org）進行保守結(jié)構(gòu)域分析，motif數(shù)目設置為15個、寬度范圍設置為1～50個氨基酸。

3. 染色體分布分析

利用HMM 3.0軟件中的perl腳本從茶樹的基因組注釋信息中獲取CsWOX基因在染色體上的起始位置信息。根據(jù)CsWOX基因兩兩之間的BLASTP比對結(jié)果獲取基因同源復制事件，最后將染色體定位和比對結(jié)果利用Circos v0.67工具進行可視化，同源或復制基因用曲線連接，最后利用GSDS 2.0進行可視化。

4. 表達模式分析

為分析茶樹CsWOX基因家族的表達情況，從茶樹基因組TPIA數(shù)據(jù)庫（http：//tpia.teaplant.org）下載它們在茶樹不同組織（花、莖、根、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉）、鹽脅迫、PEG 誘導的干旱脅迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（TPM值），同時鑒定差異表達基因[9]，結(jié)果使用TBtools軟件制作熱圖。

二、結(jié)果與分析

1. 茶樹WOX基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預測

通過2次比對搜索以及將比對的候選基因提交到SMART、Pfam、NCBI-CDD等在線網(wǎng)站進行保守域的結(jié)構(gòu)驗證，最終得到了29個茶樹WOX基因，并根據(jù)基因在染色體的位置及其同源關(guān)系對其命名。進一步對茶樹WOX基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析（表1），結(jié)果顯示，茶樹最長的WOX蛋白CsWOX27含有55 342個氨基酸殘基，最短的CsWOX13含有476個氨基酸殘基;相對分子量在14.7（CsWOX13）～93.1 kD（CsWOX28）;理論等電點（Pi）介于5.53（CsWOX03）～9.97（CsWOX10）之間，同時發(fā)現(xiàn)Pi >7的CsWOX 蛋白達到了65.52%（19個），表明大部分CsWOX蛋白富含堿性氨基酸。

2. 茶樹WOX系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

為了明確茶樹WOX家族成員的分類，將15個擬南芥WOX基因和34個大豆WOX基因的蛋白序列和29個茶樹WOX蛋白進行多序列比對并構(gòu)建進化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶樹CsWOX基因和擬南芥、水稻同源性很高，表明WOX基因物種分化非常保守，蛋白序列的相似性表明這3個物種的WOX基因可能具有相似的生物學功能。根據(jù)擬南芥和水稻的同源基因分類，將茶樹WOX家族分為4個亞家族（圖1）。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析，WOX基因不僅在茶樹、擬南芥及水稻中都有發(fā)現(xiàn)，且同源性較高，表明了WOX基因在物種分化過程中具有較高的保守性，進化時間也要早于茶樹、擬南芥和大豆的分化時間。

為深入了解茶樹WOX家族基因的功能，利用茶樹WOX基因組DNA序列和CDS序列對其基因結(jié)構(gòu)進行分析。利用MEME 軟件對茶樹WOX家族基因的保守基序組成和數(shù)目進行分析，一共鑒定到10個保守基序，依次命名為基序1到基序10（圖2）。各亞組所包含的保守基序基本一致，表明同一亞組由相似的保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，可能具有相似的生物學功能。

3. 染色體定位和CsWOX的同源基因分析

根據(jù)茶樹基因組染色體注釋信息，將鑒定到的CsWOX基因進行染色體定位（圖3）。結(jié)果顯示，6個CsWOX（CsWOX07、CsWOX14、CsWOX16、CsCCWOX17、CsWOX26、CsWOX28）基因不能定位到染色體上，其他23個CsWOX基因不均等地定位到不同染色體上，其中1、2、15號染色體上包含的基因個數(shù)最多，均有5個CsWOX基因;而3、5、9、10、12、14號染色體不含CsWOX基因。

此外，茶樹不同染色體組中同樣分布不均等，其中4、7號染色體有2個，6、8、11、13號染色體有1個，暗示了CsWOX基因在茶樹進化過程中可能發(fā)生了基因的復制或丟失。

4. CsWOX基因在茶樹中的不同組織表達分析

為了進一步明確CsWOX在茶樹中的組織表達特異性，從TPIA中下載它們在茶樹莖、頂芽、嫩葉、果、花、老葉、成熟葉、根等8個組織的轉(zhuǎn)錄組TPM表達數(shù)據(jù)，并對它們進行了分析。結(jié)果（圖4）顯示，CsWOX在多種組織中均有表達如：CsWOX01、CsWOX02、CsWOX03、CsWOX05、CsWOX06、CsWOX07、CsWOX14、CsWOX15、CsWOX16、CsWOX17、CsWOX20和CsWOX28、CsWOX29在所有組織中均具有較高的表達水平，而CsWOX04、CsWOX08、CsWOX09、CsWOX10、CsWOX12、CsWOX18、CsWOX19、CsWOX21、CsWOX23在各組織中表達較低，有部分CsWOX基因幾乎不表達，如CsWOX22。相對其他組織而言，CsWOX29在莖中的表達水平總體比其他組織的要高。同時研究發(fā)現(xiàn)CsWOX05和CsWOX06，CsWOX01和CsWOX02，CsWOX04和CsWOX08，CsWOX11和CsWOX13，CsWOX14、CsWOX15、CsWOX16和CsWOX17在各組織中表達量一樣?；虺嗽诟?、成熟葉、老葉表達量低，逐漸降低甚至不表達。在其他組織表達都較高的有CsWOX11、CsWOX13、CsWOX25等，其表達量在頂芽、嫩葉、果中較高。以上結(jié)果表明，不同CsWOX基因可能參與茶樹的不同生長發(fā)育過程。

5. CsWOX基因在干旱脅迫、鹽脅迫處理下的表達模式

對茶樹CsWOX基因在PEG誘導的干旱脅迫（0、24、48、72 h）、鹽脅迫處理（0、24、48、72 h）平均溫度達到10 ℃以上，去馴化后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，與其他基因的表達水平相比，CsWOX01、CsWOX02、CsWOX03、CsWOX20、CsWOX28和CsWOX29的表達量較高;CsWOX04、CsWOX08、CsWOX10、CsWOX12、CsWOX18、CsWOX19、CsWOX21的表達量在干旱下被抑制，其中CsWOX03基因的表達在24 h時被上調(diào)，72 h時又下降;CsWOX21的表達水平在24 h呈上調(diào)趨勢，之后被抑制;其余表達量不變。CsWOX10、CsWOX12、CsWOX18、CsWOX19、CsWOX22等基因不受干旱脅迫處理的調(diào)控（圖5）。

在鹽脅迫處理下，CsWOX10、CsWOX12、CsWOX18、CsWOX19、CsWOX22等基因的表達量在鹽脅迫下被抑制;CsWOX01、CsWOX02、 CsWOX03、CsWOX20、CsWOX28的表達量較高，而且不受鹽脅迫的調(diào)控，CsWOX21的表達水平在鹽脅迫下在24 h、72 h呈上升趨勢（圖5）。

三、討論

WOX基因家族在多個物種中已經(jīng)被鑒定。其中高粱11個、玉米21個、水稻72個[3]、紙桑10個[7]、大豆33個[10]、小桐子12個[11]，本研究在全基因組水平上一共鑒定到29個茶樹CsWOX基因。CsWOX基因等電點范圍為5.53（CsWOX03）～9.97（CsWOX10），有65.52%（19個）的茶樹WOX基因等電點大于7，表明大部分CsWOX蛋白富含堿性氨基酸，可能會在堿性亞細胞環(huán)境發(fā)揮作用，與大豆GmWOX成員的蛋白性質(zhì)基本一致。系統(tǒng)進化分析將15個擬南芥WOX基因、34個大豆WOX基因和29個茶樹WOX基因分成了4個亞家族。其中GroupⅢ是最大的一個亞家族，包括15個茶樹WOX基因，GroupⅣ是最小的一個亞家族，包括2個茶樹WOX基因，符合植物中CsWOX基因在不同亞家族的分布特征。基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，各亞族WOX基因之間差異很大，但相同亞組之間結(jié)構(gòu)較為保守。此外，茶樹WOX基因不僅在不同亞基因組中數(shù)量不同，而且在相同亞基鑒定的WOX基因數(shù)目也有所不同，說明了WOX基因在茶樹進化過程種發(fā)生了基因的保留和丟失?；驈椭平Y(jié)果說明了茶樹WOX基因在茶樹進化過程中發(fā)生了不同染色體間的復制，這些同源基因?qū)υ谶M化關(guān)系上具有良好的近緣關(guān)系。

茶樹是中國乃至全球最重要的經(jīng)濟作物之一，干旱、鹽等非生物脅迫嚴重影響了茶樹生長發(fā)育，造成了茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下滑。研究結(jié)果表明，植物WOX基因在器官形成和多條激素響應具有重要調(diào)節(jié)作用，然而WOX基因家族中還有很多調(diào)控機制尚不清楚，尤其是在木本植物中關(guān)于WOX基因家族的報道更是鮮有。本研究從基因組層面鑒定了茶樹中CsWOX基因家族，分析了它們的生物信息學特征，表達模式分析顯示它們可能在茶樹生長發(fā)育及逆境脅迫等響應中發(fā)揮重要功能。研究結(jié)果為進一步深入了解CsWOX基因參與茶樹生長發(fā)育、茶葉品質(zhì)成分變化及茶樹的器官誘導作用機制奠定基礎，但茶樹WOX基因?qū)に睾推渌婢趁{迫響應的具體機制尚不明確，需要進一步研究。

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