王曉軍 丁立波 鎖嘉偉 梁友輝

摘要：林可霉素是合成克林霉素的前體物質(zhì)，其天然成分中的林可霉素B組分的含量對于產(chǎn)品質(zhì)量和后續(xù)合成產(chǎn)物有較大影響。本研究通過采用色譜級大孔吸附樹脂，在0.6MPa、20mg/ml的進(jìn)樣濃度下進(jìn)行壓力吸附、以不同濃度磷酸-丙酮/水溶劑進(jìn)行梯度洗脫的處理工藝，得到的林可霉素解析液中的林可霉素B組分含量由3.5%降低至0.6%，并且林可霉素A組分收率不低于92%。

Abstract： lincomycin is a precursor for the synthesis of clindamycin. The content of lincomycin B in its natural component has a great influence on the product quality and subsequent synthetic products. In this study， the content of lincomycin B in Lincomycin eluent was reduced from 3.5% to 0.6%， and the yield of lincomycin a was not less than 92% by using chromatographic grade macroporous resin， pressure adsorption at 0.6MPa and 20mg / ml injection concentration， and gradient elution with different concentrations of phosphoric acid acetone / water solvent.

林可霉素（Lincomycin）又稱潔霉素，是最早被發(fā)現(xiàn)的林可酰胺類抗生素之一，其包含兩種天然組分：林可霉素A與林可霉素B。其能高效的抗大多數(shù)革蘭氏陽性菌和少量厭氧的革蘭氏陰性菌，其通過作用于敏感菌的 50S 亞基，阻止肽鏈的延長，從而影響蛋白質(zhì)的合成而達(dá)到抗菌效果?！?】其本身的毒性較低，且和其他絕大多數(shù)抗生素不會產(chǎn)生交叉耐藥性，臨床上廣泛用于由革蘭氏陽性菌感染所產(chǎn)生的疾病。其主要合成衍生物克林霉素以氯離子取代林可霉素分子中第7位的羥基的方式合成。其用途主要用來對抗各種感染性疾病，抗菌活性強，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌具有明顯抗菌活性。對衣原體、支原體、惡性瘧原蟲和弓形蟲亦有殺滅作用。但無論是直接以林可霉素作為抗菌藥物使用，還是以林可霉素為原料制備下游產(chǎn)品如克林霉素，都對其原料中的林可霉素B（以下簡稱“B組分”）有著較高的要求，從市場需求情況看，B組分含量高于1.5%的林可霉素產(chǎn)品基本沒有任何市場?！?】因此通過提取工藝手段將發(fā)酵產(chǎn)物中的B組分含量降低至合理水平，是提升林可霉素產(chǎn)業(yè)價值的重要環(huán)節(jié)?！?，4】

色譜級大孔吸附樹脂與傳統(tǒng)大孔吸附樹脂相比，其主要區(qū)別是樹脂粒度更細(xì)密，耐高壓且擁有較強的表面吸附能力，在進(jìn)行吸附洗脫過程中，可以達(dá)到傳統(tǒng)層析填料的富集和分離效果，同時具備吸附樹脂選擇性強、損耗少，可重復(fù)使用的優(yōu)點，能夠極大程度的降低成本，是一類新型純化填料【5】。本研究采用HP20SS、HC色譜3型這兩種色譜級大孔吸附樹脂，通過中低壓吸附以及復(fù)合溶劑洗脫的方式，提純林可霉素堿化濾液，降低B組分含量【6】。

1 材料與設(shè)備

表1與表2的內(nèi)容為本研究所使用的主要原料與設(shè)備儀器。

2 實驗與結(jié)果

本實驗以林可霉素發(fā)酵液為原料，通過堿處理、過濾得到含有林可霉素A、B組分的堿處理濾液，分別采用兩種色譜級大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，考察兩組分在不同樹脂中的吸附效率，并通過梯度洗脫的結(jié)果確定樹脂型號及最優(yōu)控制參數(shù)。

2.1 實驗準(zhǔn)備

使用1mol/L的氫氧化鈉溶液，將林可霉素發(fā)酵液預(yù)處理過濾后得到的濾液pH調(diào)節(jié)至9.5～10.0，20℃靜置2h，用中速濾紙二次過濾;以HPLC外標(biāo)法檢測林可霉素A、B組分含量【7】，并使用去離子水稀釋至4000ug/ml左右，得到林可霉素堿化液，其中A組分含量85.2%，B組分含量3.5%。

在兩支60×900mm不銹鋼層析柱內(nèi)，分別以濕式填裝法填裝1500mlHP20SS和HC色譜3型色譜級大孔吸附樹脂，填裝高徑比約為8左右。靜置至樹脂完全沉降堆積后，封閉層析柱，連接磁力泵系統(tǒng)。將層析柱尾接管與全自動部分收集器連接，完成設(shè)備準(zhǔn)備工作。

2.2 吸附實驗

將林可霉素堿化液導(dǎo)入進(jìn)料混合瓶，以3L/h的固定流速壓入層析柱，層析柱出液口閥門開啟，開始計量。出液量達(dá)到1000ml時啟動自動部分收集器，每200ml樣品取樣進(jìn)行HPLC檢測，計算林可霉素A組分、B組分濃度變化。實驗結(jié)果如下所示：

兩種樹脂在吸附水平上表現(xiàn)出了較為明顯的差異，HP20SS在A組分吸附容量上表現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢，為19.2g/L，同時A組分與B組分穿透體積有明顯差距，這說明該型樹脂對與兩種組分的吸附效率有明顯差異。而HC色譜3型樹脂在各項指標(biāo)上與HP20SS樹脂存在一定差距，因此本研究最終選擇HP20SS作為最優(yōu)選項。

2.3 解析實驗

結(jié)合HP20SS吸附活性集團(tuán)本身性質(zhì)以及林可霉素溶解性，以磷酸的丙酮水溶液作為解析劑，分別以磷酸0.2mol/升的25%丙酮水溶液和0.2mol/升的40%丙酮水溶液作為解析劑進(jìn)行洗脫，實驗結(jié)果如下。

25%的丙酮水溶液解析過程可以看出，隨著解析體積的增加，林可霉素A組分的解析量在逐漸增加，當(dāng)解析量達(dá)1800ml時，解析效果明顯下降，但此時B組分仍然未能解析出來。

此時更換為高濃度的40%丙酮水溶液，林可霉素A的解析效率再次提高，峰值單位含量最高可達(dá)到28550ug/ml，解析至2600ml時，A組分濃度再次下降，至2800ml時，HPLC檢測結(jié)果中開始出現(xiàn)B組分含量檢出。解析至3200ml，A組分含量接近平緩，而此時B組分含量已經(jīng)開始上升，此時結(jié)束解析。將前部解析液收集混合后進(jìn)行檢測，A組分含量為93.23%，B組分含量低于0.6%。以上述解析液繼續(xù)制備林可霉素，制的的成品A組分含量大于93%，B組分含量小于0.6%，完全達(dá)到降低B組分含量的目的。產(chǎn)品收率與原工藝相較下降1.2%，在合理范圍內(nèi)。

3 分析與討論

通過本項目研究結(jié)果可以看出，色譜級大孔吸附樹脂對于林可霉素A、B兩組分的化學(xué)吸附能力有明顯差異，HP20SS在吸附容量、吸附效率差異上有明顯優(yōu)勢。通過二級濃度的磷酸-丙酮水溶液進(jìn)行解析，能夠有效分離林可霉素A、B組分，達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量的目的。經(jīng)過色譜級樹脂層析處理后，林可霉素解析液A組分含量大于93%，B組分濃度低于0.6%，收率僅下降1.2%左右。

參考文獻(xiàn)：

[1]莊智慧，高淑紅，何岫峰，楊燦燦，秦振.響應(yīng)面法優(yōu)化林可霉素產(chǎn)量與組分[J].中國抗生素雜志，2018，43（08）：1049-1054.

[2]李華，張立，王鑫，王建國，謝書琴.林可霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化降低B組分[J].山東化工，2016，45（08）：63-64.

[3]葛友群， LX-20大孔樹脂降低鹽酸林可霉素B組分及單雜新工藝. 江西省，江西國藥有限責(zé)任公司，2014-11-22.

[4]宋玉忠，祝立新，牛金剛，杜占彬，武培，袁崗，潘建超.利用大孔吸附樹脂吸附降低林可霉素B組分的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（07）：121-122.

[5]于澤源，趙劍輝，李興國，徐雅琴，湯雪，楊昱.大孔樹脂-中壓柱層析聯(lián)用分離純化藍(lán)莓花色苷[J].食品科學(xué)，2018，39（01）：118-123.

[6]王鑫芳，劉穎，李明江，檀曉燕.用薄層色譜法檢測林可霉素B組分[J].中國生化藥物雜志，2006（06）：371+382.

[7]張其潔.高效液相色譜法測定林可霉素B組分的含量[J].抗生素，1988（03）：224-225+192.

寧夏泰益欣生物科技有限公司 銀川 賀蘭 750205