梁利 鄧炎春 楊卅 刁青云 侯春生

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100193；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

蜜蜂（Apis mellifera）與其他社會(huì)性昆蟲一樣，缺少像脊椎動(dòng)物那樣的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但它們擁有一個(gè)高效的先天免疫系統(tǒng)，由體液和細(xì)胞免疫協(xié)同抵御外源微生物[1-4]。酚氧化酶原（PPO）是一種參與昆蟲先天免疫反應(yīng)的免疫蛋白，絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以水解PPO保守序列的第51個(gè)精氨酸生成酚氧化酶（PO）[5]。實(shí)際上，PPO不僅存在于血淋巴中，也存在于角質(zhì)層中[6,7]。通常PPO通過血細(xì)胞釋放到血淋巴并被激活產(chǎn)生PO，會(huì)在傷口部位誘導(dǎo)產(chǎn)生大量黑色素，以防止血淋巴流失和微生物入侵[8-10]。PO催化酪氨酸生成3,4-二羥基苯丙氨（DOPA），并且酚類物質(zhì)氧化生成醌類物質(zhì)也是黑色素形成所必須的。雖然闡明PO在昆蟲體內(nèi)的生理生化和分子機(jī)制，有助于對(duì)其活性進(jìn)行深入理解，但是純化過程中PPO活性的不穩(wěn)定性和快速失活，進(jìn)而研究者更多關(guān)注PPO[11]。迄今為止，已從鱗翅目、雙翅目和膜翅目等昆蟲中鑒定并純化了PPO[8,12,13]。其中，Zufelato等從蜜蜂蛹血淋巴中純化出分子量為70kDa的PO，得到PO的最適pH為6.5，最適溫度為20℃[13]。隨后克隆了意大利蜜蜂的AmPPO，發(fā)現(xiàn)AmPPO在成蟲和蛹中的轉(zhuǎn)錄水平高于幼蟲和預(yù)蛹[14]。但AmPPO在不同組織中的詳細(xì)分布及影響PO活性的因素有待進(jìn)一步研究，特別是PO在體外的活性及其影響因素未見報(bào)道。

本研究利用半定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了AmPPO 在工蜂和蜂王不同組織中的分布，發(fā)現(xiàn)AmPPO 在工蜂和蜂王不同組織中均有分布。與蜂王相比，AmPPO 在工蜂各組織中的轉(zhuǎn)錄本均高于蜂王的。對(duì)PO 活性的測(cè)定表明，Cu2+與Mg2+或Ca2+組合的活性明顯高于它們單一金屬離子的活性。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究PPO 參與的黑化免疫反應(yīng)及參與該路徑的基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蜜蜂樣本

意大利蜜蜂，來自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所實(shí)驗(yàn)蜂群。采集了3 個(gè)不同蜂群的出房工蜂、未受精蜂王、受精蜂王。解剖工蜂和蜂王并收集相應(yīng)的組織（頭、胸、表皮、足、翅、中腸、血淋巴、卵巢（處女王）和氣管）。不同日齡蜜蜂采用扣王產(chǎn)卵的方法獲得，按照Schmehl 等[15]的方法進(jìn)行移蟲，培養(yǎng)幼蟲。1日齡卵，記為第一天，直到蜜蜂第21 天出房。采集5、7、9、11、13、15、17、19、21 天的幼蟲或蜜蜂，每個(gè)日齡5 個(gè)重復(fù)。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser、Quick Cut Bam HI、Quick Cut Sac I等購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；E.coliDH5α、Super Pfx Master Mix、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Pure Plasmid Mini Kit等購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技（北京）有限公司；KAPA SYBR? FAST qPCR Kits購(gòu)自KAPA Biosystems（美國(guó)）公司；Cetylpyridinium chloride購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol Reagent、GelRed核酸染料、Agarose LE購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）公司；Tryptone、Yeast Extract、Agar為Oxiod（英國(guó)）公司；PVDF膜為Bio-Rad（美國(guó)）公司；BL21(DE3)Chemically Competent Cell為全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；SDS-PAGE Gel Kit為莊盟國(guó)際生物基因科技（北京）有限公司；T4DNA連接酶為NEB（英國(guó)）公司；L-DOPA（粉末）、Millipore Western Blot ECL顯色液為Merck（德國(guó)）公司；50×TAE緩沖液、10X MOPS電泳緩沖液為生工生物工程（上海）股份有限公司；10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、10×PBS緩沖液為酷來搏科技（北京）有限公司；pET-28a載體為本實(shí)驗(yàn)室制備；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：Centrifuge 5417R 臺(tái)式微量高速離心機(jī)、Bio Spectrometer 分光光度計(jì)，德國(guó)Eppendorf 公司；TC-96/G/H(b)cPCR 擴(kuò)增儀、LineGene9600 plus FQD-96A，杭州博日科技有限公司；FR200A 凝膠成像設(shè)備，復(fù)日科技有限公司。

1.3 DNA與RNA的提取

使用基因組DNA 純化試劑盒和TissuePrep 組織破碎機(jī)，根據(jù)試劑盒說明提取工蜂和蜂王各組織總DNA，提取的DNA 在20μL 無核酸水中洗脫。提取DNA 的質(zhì)量和濃度由Qubit 2.0 熒光儀測(cè)定，并定量至50ng/μL。工蜂、蜂王組織和不同日齡幼蟲（個(gè)體），按照說明書使用Trizol 試劑提取總RNA。使用Bio Spectrometer 檢測(cè)RNA 質(zhì)量。使用去基因組PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒，按照說明書反轉(zhuǎn)錄約1000ng RNA 合成cDNA，產(chǎn)物作為qPCR 模板。

1.4 AmPPO的分布和定量分析

采用半定量PCR方法檢測(cè)AmPPO在蜂王和工蜂不同組織中的分布，并用A.mellifera翻譯起始因子eIF-2B亞單位delta（Amtif）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[16]。采用Super Pfx Master Mix進(jìn)行半定量PCR鑒定，特異性引物qPPOF:5’-TGGCATTGGCACTTGGTGTA -3’和qPPOR:5’-AGTACCGCTGGGTCGAAATG -3’。在94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。采用絕對(duì)定量的方法計(jì)算PPO基因的轉(zhuǎn)錄本水平。qPCR反應(yīng)系統(tǒng)包括7.5μL KAPA SYBR? FAST，各0.3μL的上游和下游引物（qPPO-F qPPO-R，10mM）、2μL模板cDNA和4.9μL雙蒸水；總量為15μL。95℃預(yù)變性3min；循環(huán)段95℃、3s，55℃、20s，60℃、35s（檢測(cè)熒光），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.5 AmPPO片段的擴(kuò)增

AmPPO全長(zhǎng)2082bp，編碼693個(gè)氨基酸。使用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：Forward Primer為5'-ATGGCGTCTGATAAATCGGG-3'，將其命名為PPO-F；Reverse Primer為5'-TCCAGCAGTCTATAT-3'，將其命名為PPO-R。PPO-F加入BamHI酶切位點(diǎn)，PPO-R加入SacI酶切位點(diǎn)，送生工生物（上海）有限公司合成。取蜜蜂樣品，按照說明書與Trizol提取液中提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度。參考Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板并按照Super Pfx Master Mix說明書進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性7s，56℃退火20s，72℃延伸70s，4個(gè)循環(huán)；98℃變性7s，54℃退火20s，72℃延伸70s，4個(gè)循環(huán)；98℃變性7s，52℃退火20s，72℃延伸70s，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，鑒定擴(kuò)增的效果。然后使用膠回收試劑盒，純化PPO擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 AmPPO的表達(dá)和純化

以pET-28a作為目的基因載體，載體和AmPPO經(jīng)BamHI/SacI酶切后進(jìn)行連接，并導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。以大腸桿菌BL21菌株為宿主，表達(dá)PPO（His-PPO）融合蛋白。將正確的重組載體pET28a-PPO轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中，涂布于含25μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。通過菌落PCR篩選單個(gè)陽(yáng)性菌落，將陽(yáng)性菌落加入到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中孵育過夜。然后將2.5mL培養(yǎng)物接種250ml LB，在37℃下孵育，至OD 600nm達(dá)到0.8。然后用0、0.3、0.5、0.7mM 4種濃度的異丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）在17℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)24h，在最適誘導(dǎo)濃度下找到最適誘導(dǎo)時(shí)間。250mL誘導(dǎo)菌液，4℃，12000rpm，離心10分鐘，再用25mL 1X PBS（pH7.4）重懸。將含有目標(biāo)可溶性蛋白的過濾上清液約25mL加入到含1mL His PurTMNi-NTA樹脂的重力柱中，然后用5mL不同濃度的咪唑（25、200、400mM）洗脫蛋白。用低濃度咪唑清洗未結(jié)合的雜蛋白，用5mL 400mM咪唑洗脫融合蛋白。最后，用含400mM咪唑的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離和Western blot鑒定。總之，先將80μL的蛋白樣品加入20μL 5×SDS-PAGE緩沖液中混合，然后在100℃下煮沸10min。用12%凝膠在80V、25min，120V、90min條件下電泳分離蛋白，并分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R250染色和蛋白轉(zhuǎn)膜。蛋白經(jīng)過凝膠電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。隨后，在5%的脫脂牛奶中室溫孵育2小時(shí)進(jìn)行封閉，然后加入HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽的抗體，再在室溫下繼續(xù)孵化2小時(shí)，然后用TBST清洗PVDF膜10分鐘，重復(fù)3次。最后，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)和ECL化學(xué)發(fā)光溶液完成化學(xué)發(fā)光圖像分析。

1.7 PO活性試驗(yàn)

采用BCA Protein Assay Kit測(cè)定融合蛋白的濃度。我們參考Jiang 等人的試驗(yàn)方法并進(jìn)行改進(jìn)[4]。在總體積為1mL 的體系（預(yù)混液）中，加入20L10mM 的L-DOPA，20l 的PPO（約10g）純化蛋白，40l 0.1mM的Cetylpyridinium chloride（CPC），補(bǔ)充去離子水到1mL，在490nm 下連續(xù)檢測(cè)，觀察PO 蛋白活性隨時(shí)間的變化。為探究金屬離子對(duì)PO 蛋白活性的影響，在上述預(yù)混液中分別加入終體積為25mmol/L的MgCl2，25mmol/L 的CuSO4，25mmol/L 的CaCl2，25mmol/L MgCl2和CuSO4，25mmol/L 的CaCl2和CuSO4，連續(xù)監(jiān)測(cè)490nm 下吸光度的增加情況，參考Feng 等人的方法[11]，PO 酶活單位（U）：每毫克蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗一定量的L-DOPA 定義為一個(gè)酶活性單位。PO 活性（A490/mg/min）=（A490測(cè)定-A490初始）÷質(zhì)量÷時(shí)間。為了確定溫度對(duì)PO活性的影響，將不含CPC 的預(yù)混液在恒溫箱中以不同的溫度（4℃、16℃、22℃、28℃、36℃、45℃）孵育1 小時(shí)。CPC 在4℃會(huì)析出，所以我們用雙蒸餾水代替CPC。然后在恒溫箱中加入20μL PPO（10μg），繼續(xù)孵育10 分鐘。最后，在490nm 下快速測(cè)定混合物的吸光度。為了測(cè)試pH 值對(duì)PO 蛋白活性的影響，首先將混合物在室溫下孕育10 分鐘，然后添加20μL PPO 蛋白質(zhì)（10μg）到不同pH（pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的預(yù)混液中，之后在490nm 下檢測(cè)吸光度的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmPPO的分布和轉(zhuǎn)錄水平

AmPPO在蜂王的頭部、胸部、中腸和氣管的表達(dá)量最高；而在相同條件下，在翅膀和血淋巴中檢測(cè)到微弱信號(hào)（圖1A）。在工蜂中，AmPPO在頭部、表皮和中腸表達(dá)量最高，而胸部和腿部分布較弱（圖1B）。與蜂王相比，AmPPO在工蜂各組織的轉(zhuǎn)錄本更高，其中工蜂血淋巴的轉(zhuǎn)錄本水平高于其他組織（圖1C）。圖1D顯示5-、7-、9-、11-、13-、15-、17-、19-和21日齡蜜蜂的形態(tài)，AmPPO的表達(dá)量從第5天到第11天持續(xù)增加，第11天后開始下降。第19天表達(dá)量最高，達(dá)到3.5×105，第21天下降到6.3×104（圖1E）。

圖1 AmPPO在工蜂和蜂王不同組織及不同發(fā)育階段中的分布和表達(dá)

2.2 PPO的表達(dá)和純化

構(gòu)建pET28a-PPO 的整個(gè)過程如圖2所示，陽(yáng)性菌落經(jīng)菌落PCR 確認(rèn)。擴(kuò)增的AmPPO 的核苷酸序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)正確。IPTG 濃度為0.7mM 時(shí)，可溶性蛋白含量(～81kDa)最高(圖3A)。結(jié)果顯示，PPO 蛋白的量隨咪唑濃度的增加而增加，400mM 咪唑可以洗脫全部目的蛋白(圖3B)。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-PPO的構(gòu)建示意圖

圖3 PPO的原核表達(dá)及純化

2.3 金屬離子、溫度和pH值對(duì)PO活性的影響

結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，PO 活性不斷增加，并在5min 時(shí)達(dá)到最大值(圖4A)，490nm 下的吸光值不斷增加(圖4B)。PO 在pH 5.5 時(shí)活性最高(U=5.93)，依次為pH 4.5 (U=3.97)、pH 6.5 (U=2.36)、pH 7.5(U=2.27)和pH 8.5 (U= 2.02)。pH 值為5.5 和4.5 時(shí)，PO活性比其他pH 值高2～3 倍。pH 大于5.5 時(shí)，PO 活性持續(xù)下降(圖4C)。從4℃到36℃，PO 活性隨著溫度的升高而不斷增加，達(dá)到4.83(U)，然后PO 活性開始下降，在45℃時(shí)活性最小(U=0.342)(圖4D)。單個(gè)金屬離子(Mg2+、Ca2+)對(duì)PO 活性有抑制作用，但銅離子無抑制作用。與單個(gè)離子相比，Cu2+和Mg2+、Cu2+和Ca2+的結(jié)合將使PO 活性增加2 倍以上(圖4E)。

圖4 不同條件對(duì)PO活性的影響

3 討論與結(jié)論

酚氧化酶的研究已有20 多年，大部分主要集中在酶功能和免疫機(jī)制方面[17-20]。本研究分析了AmPPO 在蜂王和工蜂不同組織中的分布以及AmPPO 在工蜂不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平。通過構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得PPO，并利用CPC 激活PPO 來探究PO 活性的影響因素。

在我們的研究中，AmPPO在蜂王和工蜂不同組織中的表達(dá)量不同（圖1A、B），且工蜂組織的轉(zhuǎn)錄本顯著高于相應(yīng)的蜂王組織（圖1C，P<0.05）。蜂王血淋巴中PPO的轉(zhuǎn)錄水平不是最高的，而且顯著低于其他組織（P<0.05）。這與Lourenco等人所描述和提出的工蜂可能需要對(duì)抗比蜂王更多的病原體的觀點(diǎn)一致[15]。AmPPO的表達(dá)量從幼蟲期到蛹期（第5～11天）持續(xù)升高，蛹期（第11～17天）下降（圖1D、1E）；19日齡時(shí)表達(dá)量最高，21日齡時(shí)下降（表皮色素沉著期）（圖1D和圖1E）。這些結(jié)果表明，酚氧化酶可能參與了表皮黑色素沉積和表皮硬化[20-22]。

許多研究表明，PPO 是昆蟲防御細(xì)菌、真菌和病毒感染所必需的[23,24]。因此，報(bào)道了大量對(duì)PPO的研究。Shi 等人在Clostera anastomosis中鑒定了21 種殺蟲劑和化感物質(zhì)對(duì)PPO的抑制作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素（quercetin）、苯硫脲（phenyl thiourea）和辛硫磷（phoxim）能強(qiáng)烈抑制PPO 活性[25]。Chen 等人發(fā)現(xiàn)特定氨基酸可以在體外影響果蠅黑腹多酚氧化酶的活性[26]。在我們對(duì)PO 活性的研究中，以CPC 作為激活劑，結(jié)果表明，PO 活性的最佳溫度和pH 值是36℃和5.5 (圖4C、D)。Zufelato等人收集蜜蜂蛹的血淋巴為PO 來源，以胰蛋白酶作為激活劑，結(jié)果顯示PO 的最適溫度和pH 值是20℃和6.5[13]。而Hara 等人和Cherqui 等人從家蠅血淋巴中純化的PPO 的最適溫度也都高于30℃[27,28]。在PO 活性試驗(yàn)中，25mM 金屬離子(Ca2+、Mg2+)對(duì)PO 活性有抑制作用，而Cu2+沒有影響。當(dāng)加入Cu2+和Ca2+或Cu2+和Mg2+，PO 活性提高2 倍(圖4E)。我們認(rèn)為，其他金屬離子和氨基酸殘基可能形成金屬配體，與金屬活性中心形成弱相互作用，抑制蛋白質(zhì)活性。當(dāng)加入兩種離子時(shí)，Cu2+會(huì)結(jié)合到活性中心位點(diǎn)，讓蛋白的空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，Ca2+或Mg2+則于非金屬位點(diǎn)上的氨基酸殘基形成金屬配體，改變了PO 的空間結(jié)構(gòu)，提高了PO 的活性[29,30]。