陳夢(mèng)婷，董志國，張殷建

青光眼作為全球第二位致盲性眼病，若不加以治療，最終可導(dǎo)致失明[1]。目前全球約有7,600 萬青光眼患者，其中失明患者約為1,120 萬[2]，預(yù)計(jì)到2040年青光眼患者可能會(huì)增至1.118 億[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。眼壓升高是青光眼的主要危險(xiǎn)因素。雖然眼壓升高的機(jī)制還未完全清楚，但可以通過藥物或手術(shù)降低眼壓以減緩青光眼造成的視神經(jīng)損害。目前，眼科學(xué)者一直對(duì)治療青光眼新藥進(jìn)行研究，探尋眼壓升高的機(jī)理以尋找新的治療藥物。另外，某些中藥也具有降低眼壓的作用，為青光眼的治療提供了更多選擇[4]。清肝利水方是上海市名老中醫(yī)、眼科專家鄒菊生的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)多年臨床應(yīng)用，具有良好的療效，課題組前期臨床研究[5]證實(shí)本方在原發(fā)性開角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）患者視力、視野平均敏感度及全身癥狀改善方面均有很好的療效，還有協(xié)同降低眼壓的作用。為驗(yàn)證清肝利水方降低眼壓的作用，采用SD 大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性眼壓升高的造模，并進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用6～8 周齡清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005）48 只，體重（150±30）g，所有大鼠毛發(fā)色澤光亮，眼外觀、眼壓均正常。飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在獨(dú)立換氣系統(tǒng)的籠具中，4 只/籠，溫度維持在21℃左右，12 h 光/暗循環(huán)照明，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，給予充足的水和活動(dòng)空間。相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理及動(dòng)物中心相關(guān)管理辦法。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹腔注射25%烏拉坦（8 ml/kg）將大鼠處死。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（國藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司）；烏拉坦（國藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司）；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥有限公司，批號(hào)：JX20160077）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥有限公司，批號(hào)：J20180051）；氧氟沙星眼膏（沈陽興齊制藥有限公司，批號(hào)：H10940177）；鹽酸左布諾洛爾滴眼液（ALLERGAN 艾爾建有限公司，批號(hào)：H20130765）；超順磁性氧化鐵磁珠（superparamagnetic iron oxide，SIO）（美 國Bangs Laboratories 公司）；OPMI VISU 顯微鏡（德國蔡司公司）；微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；手持式數(shù)字眼壓計(jì)（Tonopen XL）（美國Medtronic Solan 公司）；一次性注射器（常州雙馬醫(yī)療器材有限公司）；顯微手術(shù)器械（蘇州六六視覺科技公司）。

10%水合氯醛：取5 g 水合氯醛，加0.9%氯化鈉溶液定容至50 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。25%烏拉坦：取25 g 烏拉坦，加0.9%氯化鈉溶液定容至100 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 清肝利水方煎劑的制備

清肝利水方藥物組成為：夏枯草12 g、葛根15 g、車前子15 g、枸杞子12 g。本方生藥購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房，由上海華宇藥材有限公司提供，均為道地藥材，由上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥研究教研室專職員工進(jìn)行藥材評(píng)估。

制備方法：加入7 倍生藥重量的水沸騰煎煮2次后，將所有水煎劑混合并蒸發(fā)濃縮至最終濃度為1 g/ml。將制備好的中藥儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)按所需濃度加入大鼠飲用水中稀釋，注意所有大鼠灌胃同等體積中藥溶液，2 ml/d。

1.4 方法

1.4.1 造模 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后進(jìn)行造模。通過眼前房注射SIO 術(shù)建立穩(wěn)定的慢性高眼壓大鼠模型，參考Paulina A[6]、Chen YQ[7]、Zhang C[8]的方法對(duì)大鼠左眼進(jìn)行造模。

具體操作方法如下：先將大鼠稱重，用10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，劑量為4 ml/kg，待其無意識(shí)后使其身體側(cè)臥，暴露左眼于OPMI VISU顯微鏡下；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液眼表局部麻醉，待術(shù)眼角膜反射消失后使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液進(jìn)行擴(kuò)瞳，以減少手術(shù)引起的虹膜損傷。先用1 ml一次性無菌注射器針頭在角鞏膜緣刺一小口，以便微量注射器進(jìn)入。用振蕩器將SIO 振蕩混勻后，用25 μl 微量注射器吸取10 μl SIO 并從角鞏膜緣小口小心穿刺進(jìn)入前房角后緩慢注入SIO，注射后以小型手持磁鐵（0.45 T）將SIO 吸引至穿刺口另一端后再拔出注射針，以防SIO 經(jīng)穿刺口外流，再用磁鐵將SIO 均勻分布于眼前房以阻塞小梁網(wǎng)升高眼壓?？瞻捉M進(jìn)行假手術(shù)，用0.9%氯化鈉溶液替代SIO，以消除手術(shù)操作的影響。術(shù)后眼表予氧氟沙星眼膏覆蓋，預(yù)防感染。觀察30 min 左右，待大鼠麻醉完全蘇醒后再將其送回飼養(yǎng)室。術(shù)后1 周眼壓值持續(xù)升高，且與造模前眼壓差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）[9]，提示造模成功。

1.4.2 分組與處理 將SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，空白組、模型組、中藥低濃度組（LCG）、中藥中濃度組（MCG）、中藥高濃度組（HCG）、陽性對(duì)照組（PG），每組8 只。中藥低、中、高濃度組予清肝利水方灌胃，濃度分別為3.1 g/kg、6.2 g/kg、12.4 g/kg（按人與動(dòng)物之間體表面積關(guān)系換算得出該水煎劑的正常給藥量為6.2 g/kg，低、高濃度組給藥量為正常給藥量的1/2 和2 倍[10]），空白組、模型組、陽性對(duì)照組給予飲用水灌胃，各組劑量相同，每日1 次。除灌胃外，陽性對(duì)照組大鼠每日予鹽酸左布諾洛爾滴眼液，其余各組予0.9%氯化鈉溶液滴眼，滴左眼，每日1 次。

1.5 眼壓測(cè)定

于造模前及造模后1、3、7、14 d 測(cè)量左眼眼壓值，為減小誤差，每次于同一時(shí)間段（13:00-15:00）進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量時(shí)按造模方法將大鼠全麻和局麻，使用手持式數(shù)字眼壓計(jì)進(jìn)行連續(xù)5 次測(cè)量，取數(shù)值偏差小于5%的平均值作為眼壓值[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較，運(yùn)用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)入組情況

剔除造模失敗及后續(xù)產(chǎn)生眼底出血、白內(nèi)障等并發(fā)癥的大鼠，各組入組大鼠：空白組8 只、模型組6 只、中藥低濃度組7 只、中藥中濃度組7 只、中藥高濃度組6 只、陽性對(duì)照組6 只。

2.2 各組造模前后眼壓變化

空白組假手術(shù)后均穩(wěn)定在10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右。其余各組注射SIO 后第1 d 起眼壓均有升高，其中模型組持續(xù)升高。用藥后，中藥中濃度組、陽性對(duì)照組眼壓下降最快，第7 d 開始持續(xù)下降，直至第14 d，陽性對(duì)照組眼壓最低。

造模后，模型組眼壓均高于空白組（t1d=22.259，t3d=19.065，t7d=10.545，t14d=11.204，均P=0.000）。造模后7 d，中藥中濃度組眼壓低于中藥低、高濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLCG=58.106，tHCG=30.370，P=0.000）。各治療組與模型組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性對(duì)照組與中藥各濃度組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后14 d，各治療組眼壓均低于模型組（tLCG=20.981，tMCG=14.570，tHCG=18.737，tPG=11.539，均P=0.000）；與陽性對(duì)照組相比，中藥各濃度組眼壓均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tLCG=6.671，tMCG=6.570，tHCG=5.279，均P=0.000）。中藥各濃度組間眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 各組左眼在不同時(shí)間點(diǎn)的眼壓值（，mm Hg）

表1 各組左眼在不同時(shí)間點(diǎn)的眼壓值（，mm Hg）

注：# 與空白組比較，P<0.05；* 與模型組比較，P<0.05；&與陽性對(duì)照組比較，P<0.05；a 與低濃度組比較，P<0.05；b 與高濃度組比較，P<0.05

3 討論

青光眼以病理性眼壓增高為主要特征，隨著病情進(jìn)展，視力逐漸下降并伴有視野缺損，最終導(dǎo)致失明[1]。高眼壓壓迫視神經(jīng)纖維和鞏膜，可導(dǎo)致視神經(jīng)軸突萎縮，軸漿流受阻，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGC）的營養(yǎng)供應(yīng)不足，進(jìn)一步引發(fā)視神經(jīng)纖維的病變。并且高眼壓可通過激活線粒體凋亡信號(hào)通路以及阻礙神經(jīng)營養(yǎng)因子受體復(fù)合物的逆運(yùn)輸?shù)纫鹨暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[11]。

本次慢性高眼壓動(dòng)物模型，沿用課題組前期的造模方法[8]，采用SIO 眼前房注射以阻塞小梁網(wǎng)達(dá)到眼壓升高的效果。經(jīng)前期實(shí)踐這種造模方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成功率高，且升高眼壓效果可維持4 周以上。本次實(shí)驗(yàn)SIO 注射量為10 μl，造模后眼壓增高明顯，說明此注射量有利于高眼壓大鼠模型的更快建立。

臨床上治療青光眼以降眼壓為主，可以有效控制一部分青光眼患者視野缺失，減緩視神經(jīng)萎縮以及緩解眼部不適癥狀，但降眼壓眼藥水帶來的諸如眼干澀、結(jié)膜充血等副作用明顯，并且部分患者在降眼壓治療處理后仍無法阻止視野及視盤損害[1,11]。中醫(yī)藥在慢性青光眼的治療中有一定優(yōu)勢(shì)，越來越受到重視。清肝利水方是名老中醫(yī)鄒菊生教授治療青光眼的臨床經(jīng)驗(yàn)方，鄒老認(rèn)為本病病位在肝，病機(jī)是情志不暢致肝失疏泄，日久肝郁氣滯而化火，肝火上擾于目，致使目中脈絡(luò)阻滯，玄府郁閉，神水滯留，運(yùn)行不暢而導(dǎo)致眼脹、視物膜糊，久則損害目系[12]，故創(chuàng)立本方，方中夏枯草、葛根清肝瀉火為君藥，車前子利水為臣藥，枸杞子補(bǔ)肝腎明目為佐藥，全方共筑清肝利水明目之效。課題組在臨床研究[5]中，觀察到針對(duì)肝郁氣滯型POAG 患者，試驗(yàn)組采用清肝利水方聯(lián)合降眼壓滴眼液，對(duì)照組只使用降眼壓滴眼液，治療后試驗(yàn)組總有效率高于對(duì)照組，且在視力、平均敏感度及全身癥狀改善方面均優(yōu)于單純西藥組，證實(shí)清肝利水方可改善青光眼患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量。

本研究造模成功并經(jīng)清肝利水方干預(yù)后，中濃度組、陽性對(duì)照組眼壓下降最快，第7 d 開始持續(xù)下降，直至第14 d，陽性對(duì)照組眼壓最低，且各濃度組較模型組明顯下降。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中藥降眼壓效果與濃度有關(guān)，推測(cè)低濃度組由于中藥濃度過低，在短時(shí)間給藥后藥效不夠阻止眼壓的進(jìn)一步升高，因此降眼壓效果較差；高濃度組在造模后早期有較好的降眼壓效果，而后期效果不如中濃度組，推測(cè)清肝利水方的降眼壓效果與給藥濃度并非完全呈正相關(guān)，而是達(dá)到一定給藥濃度才能發(fā)揮較好的降眼壓效果；中濃度組為計(jì)算后的標(biāo)準(zhǔn)給藥劑量，在給藥第7 d相對(duì)低、高濃度組降眼壓效果更優(yōu)。

現(xiàn)代藥理學(xué)已驗(yàn)證了清肝利水方中的幾味中藥治療眼病的藥理作用。例如葛根的提取物葛根素是異黃酮化合物，已廣泛應(yīng)用于青光眼的臨床治療[13]，夏枯草以及夏枯草醇提物可以抑制眼內(nèi)一氧化氮（NO）的含量抑制眼病中的炎癥反應(yīng)和疼痛[14]，車前子可以抑制過量的過氧化氫（H2O2）生成引起的晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，具有抗氧化的能力[15]。枸杞子在高眼壓動(dòng)物模型中已驗(yàn)證對(duì)RGC 具有保護(hù)作用，其療效可能與結(jié)晶蛋白的上調(diào)有關(guān)[16]。清肝利水方降低眼壓的作用可能涉及血管、軸突病變、免疫、氧化應(yīng)激、自噬、細(xì)胞因子等多種機(jī)制，是清肝利水方中的哪些有效成分發(fā)揮主要作用，以及具體作用機(jī)理及機(jī)制將是進(jìn)一步研究的方向。