王貝麟，陳麒帆，門文強，田修斌，苗敬南，賀金秋，趙月，李歡歡，劉文軒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

普通小麥(TriticumaestivumL.,2n=6x=42,AABBDD)是中國乃至世界上最重要的三大糧食作物之一，種植面積約占谷類作物種植總面積的1/3[1]。在中國，小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，在國家糧食安全和社會穩(wěn)定中起著十分重要的作用。近年來，隨著人口數(shù)量的不斷增加，人均耕地面積的日益減少，氣候的異常變化，使得普通小麥對生物和非生物抗性以及產(chǎn)量等要求越來越高。

遺傳基礎(chǔ)狹窄是影響普通小麥進行遺傳改良的根本問題，向普通小麥導(dǎo)入外源優(yōu)異基因是豐富遺傳基礎(chǔ)的有效途徑[2-3]。小麥野生近緣物種類型繁多，變異多樣，具有豐富的遺傳多樣性，蘊藏著豐富的多花、多粒和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因，以及抗病蟲等生物脅迫和耐寒、耐旱等非生物脅迫基因[4-5]。通過遠緣雜交和染色體工程等遺傳操作將這些優(yōu)異基因?qū)肫胀ㄐ←?，不僅可以極大豐富小麥基因資源，同時也有助于擴大小麥育種的遺傳基礎(chǔ)。

黑麥屬于禾本科黑麥屬(SecalecerealeL., 2n=2x=14,RR)草本植物，攜帶大量抗病、抗逆、高產(chǎn)和廣適應(yīng)性等優(yōu)良基因，是普通小麥遺傳改良的重要基因資源[6-8]。黑麥Petkus的1RS染色體上攜帶有抗白粉病基因Pm8，抗葉銹病基因Lr26，抗稈銹病基因Sr31和抗條銹病基因Yr9[9-10]。黑麥German White的4R染色體上攜帶有抗白粉病基因[11]。黑麥Prolific的6RL染色體上攜帶有抗白粉病基因Pm20[12]。黑麥Baili的7R染色體長臂上攜帶有抗白粉病基因、抗條銹病基因、抗小麥赤霉病基因[1]。因此，黑麥在增加小麥的遺傳多樣性，培育抗病高產(chǎn)優(yōu)良小麥品種方面具有很大的應(yīng)用潛力。

小黑麥?zhǔn)峭ㄟ^小麥屬和黑麥屬物種間雜交、雜種F1經(jīng)染色體加倍而人工合成的新物種。目前，小黑麥主要有八倍體小黑麥(2n=8x=56,AABBDDRR)和六倍體小黑麥(2n=6x=42,AABBRR)2種類型。其中六倍體小黑麥?zhǔn)撬谋扼w硬粒小麥(2n=4x=28,AABB)與黑麥雜種F1經(jīng)染色體加倍獲得的新物種，由小麥的A和B基因組以及黑麥的R基因組所有染色體組成[13]。六倍體小黑麥既保持了普通小麥的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的特性，又結(jié)合了黑麥的抗病、耐旱、耐寒和賴氨酸含量高等優(yōu)良特性，在生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用價值[14]。但是，六倍體小黑麥廣泛存在植株極高、容易倒伏的缺點。引入主效矮化基因是植物育種家克服株高問題最簡單的方法，但是，此方法對于六倍體小黑麥不如小麥那樣有效[15]。因此，通過解析六倍體小黑麥株高原因，為進一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段降低六倍體小黑麥株高提供新方法。

本研究發(fā)現(xiàn)六倍體小黑麥84(184)自交后代分離出高稈﹑中高稈和矮稈3種株高類型，利用原位雜交和黑麥染色體特異分子標(biāo)記對六倍體小黑麥84(184)不同株高及其自交后代材料進行鑒定，分析六倍體小黑麥84(184)不同株高材料染色體構(gòu)成，并初步解析株高發(fā)生分離原因，為利用分子生物學(xué)手段降低小黑麥植株高度奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括普通小麥中國春(2n=6x=42,AABBDD)，黑麥(2n=2x=14,RR)，六倍體小黑麥84(184)及其后代高稈株系84(184)-249-2、84(184)-251-3和84(184)-253-7，中高稈株系84(184)-250-3和84(184)-251-5，矮稈株系84(184)-249-3和84(184)-253-1。小黑麥84(184)是河南天民種業(yè)有限公司從國際玉米小麥改良中心的六倍體小黑麥MZAleondBeer與寶豐7228的雜交后代選育出的六倍體小黑麥。以六倍體小黑麥84(184)為中間材料，育成了豫麥66(蘭考906)等蘭考系列超高產(chǎn)多抗小麥新品種[16]。六倍體小黑麥及其不同株高材料由河南天民種業(yè)有限公司提供，六倍體小黑麥不同株高自交后代材料和黑麥由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院染色體與基因工程實驗室繁殖保存。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

2017—2018和2018—2019年度，于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教示范園區(qū)種植所有供試材料，種子單粒穴播，行長2.00 m，株距0.10 m，行距0.30 m。3行區(qū)，重復(fù)3次，四周設(shè)置保護行。常規(guī)田間管理，所有材料均未發(fā)生倒伏。在小黑麥乳熟期，參考ZADOKS等[17]的方法調(diào)查小黑麥84(184)不同株高植株和自交后代材料的株高，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 細胞學(xué)鑒定

小麥根尖細胞有絲分裂中期染色體制片參照HUANG等[18]的方法。將待檢測植株種子置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿，加水至浸沒種子，于24 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽。待主根長至1.5～2.0 cm時，將0.2 μmol·L-1APM(Methyl Glyphosate)倒入培養(yǎng)皿浸沒種子24 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用清水沖洗種子3次后剪取種子根，放入N2O罐中處理2 h，將根置于90%乙酸固定10 min，最后放入70%的乙醇置冰箱中保存?zhèn)溆谩?～7 d后在45%的乙酸中壓片。

基因組原位雜交參照LIU等[19]的方法。用綠色熒光素(fluorescein-12-dUTP)標(biāo)記的黑麥基因組DNA作探針，普通小麥中國春基因組DNA作封阻，探針∶封阻=1∶40，對小麥背景下的黑麥外源染色體進行檢測。在Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡下觀察，AxioCam MRc5 CCD照相、保存。

1.4 分子標(biāo)記鑒定

取試驗材料的兩葉一心期幼葉，采用CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide)方法提取基因組DNA[20]。黑麥1R～7R染色體臂特異分子標(biāo)記參考LI等[21]和DAI等[22]提供的分子標(biāo)記(表1)。15.0 μL的PCR反應(yīng)體系包含2.0 μL基因組DNA(200 mg·L-1)、7.5 μL Taq MasterMix、上下游引物各1 μL(5 μmol·L-1)、3.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，63 ℃退火20 s，每個循環(huán)降低0.5 ℃，72 ℃延伸2 min，10個循環(huán)；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸 10 min。

表1 黑麥1R-7R染色體臂特異分子標(biāo)記 Table 1 Rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers

分子標(biāo)記TNAC1048，TNAC1685和TNAC1834的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ在37 ℃酶切3.5 h。分子標(biāo)記TNAC1019和TNAC1943的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶TaqI在65 ℃酶切3.5 h。5.0 μL酶切反應(yīng)體系包括2.85 μL ddH2O，2.0 μL CutSmart buffer，0.15 μL限制性內(nèi)切酶。PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測，最后在全自動凝膠成像系統(tǒng)中掃描。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2013和SPSS 20.0軟件進行方差分析和平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變幅的計算，并采用最小顯著極差法(shortest significant range,LSR)比較株高差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 六倍體小黑麥84(184)后代不同株系的株高分析

對84(184)后代不同株系的株高進行測量分析，發(fā)現(xiàn)不同株系之間株高差異很大。其中矮稈株系84(184)-249-3和84(184)-253-1無株高分離，平均植株高度分別為39.7和37.5 cm。高稈株系84(184)-249-2，84(184)-251-3和84(184)-253-7株高均無分離，分別達到79.1，88.4和78.9 cm。中高稈株系84(184)-250-3和84(184)-251-5出現(xiàn)高﹑中高和矮稈分離，前者高﹑中高和矮稈植株分別為51，83和30株，后者高﹑中高和矮稈植株分別為48，80和29株；所分離的中高稈植株的平均株高分別為58.2和56.0 cm，而高稈和矮稈植株平均株高分別與高稈和矮稈株系相同。方差分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，小黑麥84(184)不同株高類型材料之間的株高存在顯著差異，依次相差20 cm左右(表2)。

表2 六倍體小黑麥84(184)后代不同株系的株高分析Table 2 Analysis of plant height of different progeny lines of hexaploid triticale 84(184)

2.2 小黑麥84(184)不同株高材料GISH鑒定結(jié)果

為了分析小黑麥84(184)不同材料株高差異原因，利用GISH技術(shù)對84(184)不同株高植株根尖細胞進行了細胞學(xué)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高稈植株細胞共有42條染色體，其中小麥染色體28條，黑麥染色體14條(圖1A)；中高稈植株41條染色體，包含28條小麥染色體和13條黑麥染色體，缺少了1條黑麥染色體(圖1B)；而矮稈植株40條染色體，包含28條小麥染色體和12條黑麥染色體，缺少了2條黑麥染色體(圖1C)。

黑麥基因組DNA探針標(biāo)記為綠色信號，小麥染色體由DAPI復(fù)染為藍色。A：六倍體小黑麥高稈植株84(184)-249-2 (2 n=42)，B：六倍體小黑麥中高稈植株84(184)-250-3 (2 n=41)，C：六倍體小黑麥矮稈植株84(184)-249-3 (2 n=40)。Rye genomic DNA was labeled with fluorescein-12-dUTP and visualized with green fluorescence.Wheat chromosomes were counterstained with 4,6-diamino-2-phenyl indole (DAPI) and visualized with blue fluorescence.A:hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height (2 n=42),B:hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height (2 n=41),C:hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height (2 n=40).

為了分析小黑麥84(184)中高稈植株和矮稈植株缺少的黑麥染色體歸屬，首先利用LI等[21]和DAI等[22]開發(fā)的黑麥染色體分子標(biāo)記，對中國春和黑麥基因組DNA進行分子標(biāo)記檢測，從中篩選出了14個黑麥1R～7R染色體長﹑短臂特異的分子標(biāo)記(表1)。利用篩選到的14個黑麥1R～7R染色體長短臂特異分子標(biāo)記，對小黑麥矮稈植株、中高稈植株和高稈植株進行鑒定。發(fā)現(xiàn)14個黑麥染色體長臂和短臂特異分子標(biāo)記在小黑麥84(184)高稈植株和中高稈植株中均能擴增出特異條帶(圖2)。但是，在矮稈植株中，除黑麥2R染色體短臂特異分子標(biāo)記CMS2R-14和長臂特異分子標(biāo)記TNAC1142無目的條帶擴增外(圖2C～D)，其余12個特異分子標(biāo)記均能擴增出特異條帶(圖2)。因此，矮稈植株細胞中缺少的2條黑麥染色體是1對2R染色體。由此推斷黑麥2R染色體上應(yīng)該攜帶有控制株高的基因。

M：100 bp ladder DNA marker；1：中國春；2：六倍體小黑麥矮稈植株84(184)-249-3；3：六倍體小黑麥中高稈植株84(184)-250-3；4：六倍體小黑麥高稈植株84(184)-249-2。A～N：黑麥1R-7R染色體長短臂特異分子標(biāo)記。TNAC1048/HaeⅢ(1RL)，TNAC1019/TaqI(1RS)，CMS2R-14(2RS)，TNAC1142(2RL)，TNAC1248(3RS)，TNAC1267(3RL)，TNAC1457(4RS)，TNAC1943/TaqI(4RL)，TNAC1497(5RS)，TNAC1541(5RL)，TNAC1685/HaeⅢ(6RS)，TNAC1702(6RL)，TNAC1623(7RS)，TNAC1834/HaeⅢ(7RL)。箭頭表示黑麥染色體臂特異分子標(biāo)記擴增結(jié)果。M:100 bp ladder DNA marker；1:wheat landrace Chinese Spring；2:hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height；3:hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height；4:hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height.A-N:Rye 1R-7R chromosome-arm specific molecular markers TNAC1048/HaeⅢ(1RL).TNAC1019/TaqI (1RS),CMS2R-14(2RS),TNAC1142(2RL),TNAC1248(3RS),TNAC1267(3RL),TNAC1457(4RS),TNAC1943/TaqI (4RL),TNAC1497(5RS),TNAC1541(5RL),TNAC1685/HaeⅢ(6RS),TNAC1702(6RL),TNAC1623 (7RS),TNAC1834/HaeⅢ (7RL),respectively.Arrows indicate the polymorphic results of rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers.

本研究利用14個黑麥1R～7R染色體長短臂特異分子標(biāo)記對小黑麥84(184)高稈、中高稈和矮稈植株自交后代進行了進一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高稈植株后代均可以擴增出14個1R～7R黑麥染色體臂特異分子標(biāo)記的目的條帶(圖3)；在矮稈植株后代，黑麥2R染色體短臂特異分子標(biāo)記CMS2R-14和長臂特異分子標(biāo)記TNAC1142均不能擴增出目的條帶，而其余12個黑麥染色體臂特異的分子標(biāo)記均能擴增出目的條帶(圖3)；在中高稈植株自交后代中，黑麥1R和3R～7R染色體臂特異的12個分子標(biāo)記均能擴增出目的條帶，而黑麥2R染色體短臂特異分子標(biāo)記CMS2R-14和2R染色體長臂特異分子標(biāo)記TNAC1142則發(fā)生分離(圖3)。對小黑麥84(184)不同株高植株自交后代的分子標(biāo)記分析進一步確定小黑麥84(184)的株高分離和2R染色體有關(guān)，包含1對黑麥2R染色體植株表現(xiàn)高稈；只包含1條2R染色體的單株為中高稈；而缺少1對2R染色體的植株則表現(xiàn)為矮稈。

M：100 bp ladder DNA marker；1～6：六倍體小黑麥矮稈植株84(184)-249-3后代；7～13：六倍體小黑麥中高稈植株84(184)-250-3后代；14～24：六倍體小黑麥高稈植株84(184)-249-2后代。A～G：部分黑麥1R-7R染色體長短臂特異分子標(biāo)記TNAC1019/TaqI(1RS)，TNAC1142(2RL)，TNAC1248(3RS)，TNAC1943/TaqI(4RL)，TNAC1497(5RS)，TNAC1702(6RL)，TNAC1623(7RS)。箭頭表示黑麥染色體臂特異分子標(biāo)記擴增結(jié)果。M:100 bp ladder DNA marker；1-6:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-249-3 with dwarf plant height；7-13:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-250-3 with medium high plant height；14-24:The progenies of hexaploid triticale 84(184)-249-2 with high plant height.A-G:Rye 1R-7R chromosome-arm specific molecular markers TNAC1048/HaeⅢ (1RS),TNAC1142 (2RL),TNAC1248 (3RS),TNAC1943/TaqI (4RL),TNAC1497 (5RS),TNAC1702 (6RL),TNAC1623 (7RS),respectively.Arrows pointed to the polymorphic bands of rye 1R-7R chromosome arm-specific molecular markers.

3 結(jié)論與討論

隨著外源物種成功地轉(zhuǎn)移至小麥，準(zhǔn)確、快速和高效地鑒定小麥背景中的外源染色質(zhì)顯得格外重要。利用基因組原位雜交技術(shù)可以成功檢測小麥背景下多種外源的染色體或染色體片段。LI等[23]利用基因組原位雜交技術(shù)成功鑒定出39個小麥-冰草2P異源易位系。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，目前鑒定小麥背景中外源染色質(zhì)的方法趨向于分子標(biāo)記，因其不受環(huán)境和生育期的限制、且簡單易操作、成本低、效率高等優(yōu)點，被越來越多地應(yīng)用于小麥背景中外源物質(zhì)的檢測[24]。LI等[25]結(jié)合原位雜交和簇毛麥6V染色體長臂特異分子標(biāo)記成功鑒定到6個小麥-簇毛麥易位系。本研究發(fā)現(xiàn)六倍體小黑麥84(184)后代不同株系株高存在著顯著差異。為了解析株高分離原因，綜合原位雜交和黑麥1R～7R染色體特異分子標(biāo)記，對84(184)不同株高類型材料鑒定分析，發(fā)現(xiàn)84(184)矮稈植株缺失了1對2R染色體，為2R缺體，中高稈植株僅有1條2R染色體，為2R單體，高稈植株含有1對2R染色體，為2R二體。

六倍體小黑麥兼具小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)以及黑麥抗性強等特點，同時小黑麥植株高大，生物產(chǎn)量高，也是優(yōu)良的飼草和潛在的能源作物[26]。但是植株過高容易倒伏，不僅不利于機械化收割，還進一步導(dǎo)致產(chǎn)量降低和品質(zhì)受損[27]。引入主效矮化基因是降低株高最簡單的方法，但這一方法對六倍體小黑麥的矮化效果有限，且存在與種子皺癟等不良農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)問題[28]。因此，解析六倍體小黑麥株高的遺傳與分子基礎(chǔ)，可以為降低小黑麥株高、提高其利用價值提供參考依據(jù)。本研究通過對六倍體小黑麥不同株高類型鑒定分析，發(fā)現(xiàn)六倍體小黑麥84(184)中的2R染色體與植株高度有密切關(guān)系。缺少1條黑麥2R染色體可導(dǎo)致植株高度平均降低25.0 cm，降低30.45%；而缺少1對黑麥2R染色體可致使株高平均降低43.1 cm，降低52.98%，因此，推斷2R染色體上攜帶有對株高起正向疊加效應(yīng)的不完全顯性基因。該基因的缺失可以顯著降低小黑麥植株的高度。

總之，本研究綜合原位雜交和黑麥染色體特異分子標(biāo)記對六倍體小黑麥84(184)不同株高材料鑒定分析，發(fā)現(xiàn)2R染色體上攜帶有正向影響株高的不完全顯性基因。本研究對黑麥2R染色體攜帶的株高控制基因進行定位與克隆進一步研究提供理論依據(jù)，通過分子生物學(xué)手段還可為降低小黑麥植株高度奠定基礎(chǔ)。