關新剛，王明月，穆業(yè)騰，郭 沖

(北華大學醫(yī)學技術學院，吉林 吉林 132013)

免疫檢查點(Immune checkpoint)是一類在免疫細胞表面表達的起負性調控作用的受體分子[1].在正常生理狀態(tài)下，免疫檢查點發(fā)揮防止免疫過激引發(fā)的自身損傷作用.在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞通過高表達免疫檢查點配體分子逃避免疫系統的監(jiān)視與攻擊[2].信號調節(jié)蛋白α(signal regulatory protein-α，SIRPα)是表達在巨噬細胞、樹突細胞等髓系細胞表面的吞噬信號檢查點，CD47分子與其結合后發(fā)出“別吃我”信號，阻止巨噬細胞吞噬作用[3].腫瘤細胞通過高表達CD47分子，利用CD47/SIRPα信號軸使腫瘤逃避吞噬及T細胞活化，是造成腫瘤免疫逃逸的重要因素之一[4].

研究[5]顯示：CD47分子在多種惡性腫瘤細胞表面高水平表達，與癌癥患者的不良預后密切相關，提示靶向干擾CD47/SIRPa信號軸可能成為有前景的治療策略.目前，CD47單克隆抗體、SIRPa單克隆抗體、SIRPa-Fc融合蛋白等已被批準進入臨床實驗并初步顯示出良好的療效[6-8].

外泌體是細胞衍生的納米囊泡，參與細胞間的物質運輸與信息傳遞，具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性、滲透性以及低免疫原性[9].利用基因工程方法對細胞膜蛋白基因改造可以制備表面表達功能性蛋白的外泌體，從而賦予外泌體新的功能[10-11].此外，外泌體還可以作為小分子或核酸藥物的遞送載體將其遞送至特定類型的細胞或組織，以實現靶向藥物遞送[12-14].本研究中，我們制備分離了表面表達SIRPα受體的外泌體，以探討SIRPα外泌體的細胞相容性，并分析SIRPα外泌體與B16F10細胞的結合及對CD47/SIRPα信號通路的阻斷作用.

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

穩(wěn)定表達SIRPα-GFP融合蛋白的HEK293T細胞系由北華大學醫(yī)學技術學院實驗室構建；NIH3T3細胞由北華大學醫(yī)學技術學院實驗室保存；蛋白分子量標準品、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)及ECL底物顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；凝膠成像系統、蛋白電泳和轉膜系統(Bio-Rad公司，美國)；倒置熒光顯微鏡(LifeTechnology公司，美國)；全自動多功能酶標儀(TECAN公司，瑞士)；納米粒度及Zeta電位分析儀(Microtrac Nanotrac WaveⅡ，美國).

1.2 外泌體分離

穩(wěn)定表達SIRPα-GFP融合蛋白的HEK293T細胞系置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞生長至80%時進行饑餓處理，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，加入不含血清的培養(yǎng)基中，饑餓培養(yǎng)48 h后收集上清液，將含有外泌體的培養(yǎng)基依次300 g離心10 min、2 000 g離心10 min和10 000 g離心30 min，以去除細胞碎片和其他細胞成分.通過0.22 mm孔過濾器過濾后，將過濾的上清以35 000 r/min超速離心2 h.將獲得的外泌體重懸于含有蛋白酶抑制劑(Roche)的PBS中，并使用BCA蛋白測定試劑盒(Bio-Rad)檢測分離的外泌體蛋白質濃度.

1.3 外泌體的表征與鑒定

將外泌體重懸于PBS中，應用納米粒度及Zeta電位分析儀測定外泌體的粒徑；取一滴外泌體，懸液滴加在銅網上，室溫靜置等待10 min；用濾紙小心吸干銅網邊緣多余的液體，再將磷鎢酸滴加在銅網的表面，室溫靜置等待1 min；用雙蒸水沖洗過量的染液，等待晾干，透射電子顯微鏡拍照.

用蛋白裂解液冰上裂解外泌體30 min.取30 μg總蛋白經12% SDS-PAGE凝膠分離，25 V恒壓14 min轉移到PVDF膜上.PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉2 h，與稀釋后的SIRPα一抗(1∶1 000稀釋)及Na+/K+ATPase一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃搖床孵育過夜.過夜后的PVDF膜用TBST清洗3次，每次10 min，再與羊抗鼠二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，經TBST洗膜3次，10 min/次.膜置于顯影儀曝光板上，將特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(BeyoECL Star)中的A液和B液按1∶1混合，覆蓋到膜上，曝光30 s，拍攝圖像，若在相對分子質量83 000附近有清晰條帶出現則提示分離的外泌體上存在SIRPα-GFP融合蛋白的表達.

1.4 細胞相容性分析

將NIH3T3細胞以每孔5×103個細胞接種于96孔板中過夜培養(yǎng)后，向每孔內加100 μL不同濃度的SIRPα外泌體(終濃度為5、10、20、50、75和100 μg/mL)，繼續(xù)孵育48 h；每孔加入20 μL MTT，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，去孔內液體，再向每孔加入150 μL DMSO，然后將96孔板放置于振蕩器中振蕩，待沉淀完全溶解后，使用酶標儀測490 nm處的吸光度值，每組實驗設置5個平行孔.通過軟件GraphPad Prism 5作圖，確定各組的相對細胞存活率，進而評估外泌體的細胞相容性.

1.5 細胞內吞研究

將圓形玻璃片用蒸餾水清洗干凈，在無水乙醇浸泡過夜后，用蒸餾水再次清洗，高壓滅菌后置于24孔板底部，每孔加入500 μL細胞培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，將B16F10細胞以6×104個/孔接種于孔板內，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基后每孔加入用基礎培養(yǎng)基稀釋的濃度為100 μg/mL的外泌體(DIO染色)、SIRPα外泌體各300 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h.4 h后棄去培養(yǎng)基后用PBS洗3次，加300 μL 4%多聚甲醛，37 ℃固定20 min；棄去孔內液體并清洗后，加入300 μL DAPI(終濃度為1 μg/mL)染色液對細胞核進行染色，37 ℃染色10 min；再用PBS洗3次后，取潔凈的載玻片，滴加少量抗熒光淬滅封片劑，將細胞爬片覆蓋在載玻片上，并用指甲油封片，避光保存，熒光顯微鏡(LifeTechnology)進行成像分析.

1.6 巨噬細胞吞噬實驗

分離骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow-derived macrophages，BMDM)，將C57BL/6小鼠斷頸處死后在75%酒精中浸泡5 min，將皮膚剝離至足部，用剪刀分離股骨與脛骨并置于無菌PBS中，繼續(xù)去除骨外組織.將剝離干凈的股骨與脛骨置于75%酒精中浸泡1 min，用無菌PBS沖洗5次.剪斷骨兩端，用注射器吸取基礎培養(yǎng)基，沖洗骨髓，直至骨頭發(fā)白，用槍吹打懸液，使細胞盡量勻散，用75 μm濾網過濾3次.1 500 r/min 10 min離心后棄除上清，再在沉淀中加入3倍沉淀體積的紅細胞裂解液，室溫裂解5 min.1 200 r/min 5 min離心獲得骨髓細胞沉淀，用BMEM培養(yǎng)基(終濃度50 ng/mL M-CSF的完全培養(yǎng)基)重懸，以6×106個/mL濃度接種細胞，培養(yǎng)3 d后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 d再次更換新的培養(yǎng)基.

將上述所制備BMDM用Calcein AM染色，37 ℃ 30 min后用PBS清洗5次；經DiI染色消化后的B16F10細胞用PBS清洗5次，去除殘留染料.將染色后的B16F10細胞分別與CD47單抗(終濃度100 μg/mL)、SIRPα外泌體(終濃度100 μg/mL)及巨噬細胞在無血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，在37 ℃下孵育4 h后，應用胰蛋白酶消化5 min，除去未結合的B16F10細胞，通過共聚焦顯微鏡觀察其吞噬作用.

2 結 果

2.1 SIRPα外泌體的制備

本實驗室前期制備了穩(wěn)定表達SIRPα-GFP的HEK293T細胞系[15]，在此基礎上通過差異超速離心外泌體，研究外泌體的粒徑及形貌特征.動態(tài)光散射結果見圖 1，外泌體粒徑為30～100 nm；透射電鏡結果見圖2，外泌體在鏡下呈現為圓形或橢圓形結構，與文獻[16]報道的外泌體特征一致.

圖1 SIRPα外泌體的尺寸大小表征Fig.1Size characterization of SIRPα exosomes

圖2 SIRPα外泌體的形貌表征(標尺100 nm)Fig.2Structural characterization of SIRPα exosomes

我們隨后利用SIRPα單克隆抗體進行了Western blot實驗，驗證外泌體表達SIRPα分子的情況.結果見圖3.SIRPα-GFP穩(wěn)定表達細胞上清液中的外泌體泳道發(fā)現清晰單一的條帶，與預計分子量大小一致，而轉染空載體的HEK293T細胞培養(yǎng)上清液中制備的外泌體未檢測到對應的蛋白條帶，提示成功制備了表達SIRPα分子的外泌體.

1.空白外泌體；2.SIRPα外泌體.圖3 Western blotting檢測外泌體中SIRPα-GFP的表達Fig.3Western blotting analysis of SIRPα-GFP expression in exosomes

2.2 SIRPα外泌體的細胞相容性分析

為了檢測SIRPα外泌體的細胞相容性，我們利用MTT法檢測不同蛋白濃度的SIRPα外泌體對NIH3T3細胞增殖能力的影響.結果見圖4.加入外泌體培養(yǎng)48 h后各濃度外泌體處理組細胞存活率接近或超過100%，說明SIRPα外泌體具有良好的細胞相容性.

圖4 SIRPα外泌體的細胞相容性Fig.4Biocompatibility of SIRPα exosomes

2.3 SIRPα外泌體的細胞內吞

為了研究SIRPα外泌體能否被黑色素瘤細胞內吞，我們利用SIRPα-GFP的綠色熒光檢測了外泌體與黑色素瘤細胞孵育后的熒光分布.為了研究SIRPα外泌體與不表達SIRPα的外泌體在細胞分布中的區(qū)別，我們使用DiO標記的空白外泌體作為對照.結果見圖5.SIRPα外泌體與B16F10細胞共孵育4 h后，在黑色素瘤細胞的胞質區(qū)域觀察到了亮綠色的熒光，而不表達SIRPα外泌體只有少量熒光分布，且熒光強度顯著低于SIRPα外泌體處理組，提示SIRPα外泌體較空白外泌體具有更高的黑色素瘤細胞內吞效率，這可能是由于SIRPα與腫瘤細胞表面的CD47分子結合所介導的結果.

圖5 SIRPα外泌體的黑色素瘤細胞內吞Fig.5Cellular uptake of SIRPα exosomes by B16F10 cells

2.4 SIRPα外泌體促進腫瘤細胞吞噬

為了研究SIRPα外泌體與腫瘤細胞表面的CD47結合后能否阻斷“別吃我”信號，增強巨噬細胞吞噬腫瘤能力，我們以CD47單抗作為陽性對照檢測了SIRPα外泌體對巨噬細胞吞噬腫瘤的影響.將SIRPα外泌體加入BMDM細胞與黑色素瘤細胞B16F10共培養(yǎng)，B16F10細胞和BMDM細胞分別用DiI(紅色)和CalceinAM染色(綠色)共培養(yǎng)，分別加入SIRPα外泌體或CD47單抗.結果見圖6.陰性對照組只檢測到綠色熒光，說明腫瘤細胞未被巨噬細胞吞噬；而SIRPα外泌體與CD47抗體處理組細胞均檢測到了紅色和綠色熒光共定位產生的黃色熒光，提示SIRPα外泌體與CD47抗體均能夠與腫瘤細胞上的CD47分子結合，阻斷CD47/SIRPα信號通路介導的“別吃我”信號，促進了巨噬細胞吞噬腫瘤.

綠：巨噬細胞；紅：黑色素瘤細胞.圖6 SIRPα外泌體激活巨噬細胞吞噬腫瘤 Fig.6Phagocytosis of tumor cells by macrophage mediated by SIRPα exosomes

3 討 論

靶向巨噬細胞的癌癥免疫治療已成為一種有前景的治療策略[17].然而，高效激活巨噬細胞增強機體抗腫瘤免疫應答存在兩個關鍵問題：首先，癌細胞的CD47分子通過與巨噬細胞上SIRPα特異性結合，發(fā)出“別吃我”信號，防止巨噬細胞的吞噬作用[18]；其次，癌細胞分泌的集落刺激因子等能促使腫瘤相關的巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)極化成致瘤性M2表型[19].針對CD47/SIRPα信號軸阻斷的單克隆抗體、重組蛋白等藥物已經初步顯示出良好的效果，開發(fā)新型CD47/SIRPα信號軸阻斷藥物對癌癥免疫治療具有重要意義[20].

外泌體作為細胞自身生成的內源性囊泡近年來在生物醫(yī)學領域正引起越來越多的關注[21-22].生物工程改造策略為拓展外泌體功能應用奠定了基礎[23].在本研究中，我們制備分離表達SIRPα分子的外泌體，其通過破壞CD47/SIRPα信號軸來增強巨噬細胞吞噬腫瘤、激活腫瘤抗原呈遞及T細胞活化.SIRPα外泌體不僅具有CD47抗體的腫瘤“別吃我”信號阻斷功能，還具有外泌體本身優(yōu)勢，因此，我們預期SIRPα外泌體可能具有較CD47抗體更強的腫瘤抑制效果.

綜上所述，本研究成功制備分離了表達SIRPα蛋白的外泌體，SIRPα外泌體具有良好的生物相容性，并且可以被黑色素瘤B16F10高效內吞并分散在細胞質中，SIRPα外泌體能夠阻斷CD47/SIRPα信號通路，激活巨噬細胞的腫瘤吞噬功能，有望在未來作為新型CD47/SIRPα信號通路阻斷劑用于臨床癌癥治療.