張皓淳

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

奶牛的乳房一旦出現(xiàn)病癥，會(huì)直接影響牛奶品質(zhì)。一般來(lái)說，奶牛乳房炎多由機(jī)械性刺激、病原微生物侵入以及化學(xué)、物理性損傷引發(fā)，因此通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，分析關(guān)聯(lián)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，有助于從分子學(xué)角度確定誘因，從而“對(duì)癥下藥”。1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備的選用

運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)檢查奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，選用的設(shè)備如下：美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的Sigma3-18K離心機(jī)、美國(guó)Labnet公司生產(chǎn)的Labnet 230VEU渦旋儀、美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI 7200 PCR儀、美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的Nanodrop ND1000分光光度計(jì)、北京TIANGEN公司生產(chǎn)的PCR Master Mix、德國(guó)Qiangen公司生產(chǎn)的QIAquick Gel Extraction Kit。

1.2 檢測(cè)方法及流程

1.2.1 樣品采集及預(yù)處理。為了使測(cè)試結(jié)果具備對(duì)照效果和足夠的說服力，從某奶牛牧場(chǎng)選取了患有乳房炎的奶牛，對(duì)其乳頭進(jìn)行擦拭，獲取樣品。同時(shí)對(duì)該奶牛所產(chǎn)牛奶也進(jìn)行樣本收集。首先，在進(jìn)行樣本擦拭收集時(shí)，需要考慮樣本中微生物的活性，因此使用無(wú)菌棉簽，蘸少量具備滅菌功能的生理鹽水，對(duì)奶牛的乳頭進(jìn)行擦拭，獲得樣本后密封入無(wú)菌存儲(chǔ)管中；其次，對(duì)奶牛乳頭進(jìn)行清潔處理后，擠出牛奶，同樣密封入無(wú)菌存儲(chǔ)管中。為了保證實(shí)驗(yàn)的客觀性，共收集患病奶牛奶頭擦拭樣本9個(gè)，其序號(hào)分別為HB1～HB9，由患病奶牛所產(chǎn)牛奶樣本5個(gè)，編號(hào)為HBN1～HBN5；同時(shí)收集未患病且身體健康的奶牛奶頭擦拭樣本兩個(gè)，序號(hào)為ZC1～ZC2；正常牛奶樣本兩份，序號(hào)為ZCN1～ZCN2。為了保持樣本中微生物活性及其他成分不會(huì)發(fā)生變化，從牧場(chǎng)到實(shí)驗(yàn)室的過程中，所有樣本均存放在-80℃的冰箱內(nèi)。

1.2.2 提取DNA以及16S rRNA基因擴(kuò)增及高通量測(cè)序之后，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，將模糊及“斷斷續(xù)續(xù)”的序列清除出分析序列，根據(jù)序列總長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，刪除的長(zhǎng)度大約為500 bp。使用Mothur Version 1.39.1軟件包中的Miseq SOP程序開展分析,經(jīng)過去除Chimera后對(duì)序列進(jìn)行分類信息分析,Threshold參數(shù)為80,數(shù)據(jù)庫(kù)的序列和分類信息來(lái)源為SILVA SSURef database v128。

1.2.3 通過對(duì)可造作分類單元及發(fā)育系統(tǒng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合序列相似度為97%的情況對(duì)OTUs進(jìn)行分析，經(jīng)過對(duì)每個(gè)OTU序列數(shù)目的統(tǒng)計(jì)之后，可以將序列比例超過10%的OTU分別存放，用于后續(xù)的比對(duì)分析。之后在其他OTU中選擇序列，通過Blast比對(duì)方式，完成其與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)工作。

1.2.4 挑選出只具備1條序列的OTU，計(jì)算其覆蓋度，應(yīng)用的公式為C=[1-(n1/N)]×100。其中n1指代序列數(shù)量，即OTU序列只有1條；N代表序列的總數(shù)。經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的對(duì)比后，需要計(jì)算全體序列之間的差異，得出Cutoff值為0.03。將輸出的距離矩陣文件使用Cluster命令進(jìn)行聚類,繼而使用rarefaction.single命令分別計(jì)算各個(gè)樣品的OTU數(shù)目、Chao1和ACE指數(shù)。此后，使用Thetayc算法對(duì)所有樣品的序列計(jì)算距離矩陣和聚類,并進(jìn)行聚類分析[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳房炎微生物群落樣品測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)

根據(jù)16S rRNA基因序列測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣品中的微生物群落構(gòu)成及其多樣性進(jìn)行分析，為了保證客觀性，濾除并冗余處理樣本中原始序列條帶中質(zhì)量較低的部分，經(jīng)過處理后得到的患乳房炎奶牛奶頭與正常奶牛奶頭擦拭樣本序列數(shù)及多樣性指數(shù)如表1所示?；既榉垦啄膛Ｄ填^擠出的牛奶樣本與正常牛奶樣本的序列數(shù)及多樣性指數(shù)如表2所示。根據(jù)表中數(shù)據(jù)分析可得出如下結(jié)論：第一，無(wú)論奶牛患病與否，奶頭擦拭樣本中的OTU數(shù)目及微生物的多樣性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過牛奶樣本中的對(duì)應(yīng)數(shù)量。第二，患乳房炎奶牛奶頭擦拭樣本中OTU數(shù)目和微生物多樣性比正常奶牛奶頭擦拭樣本中對(duì)應(yīng)數(shù)量高。第三，患乳房炎奶牛所產(chǎn)牛奶樣本中OTU數(shù)目和微生物多樣性比正常奶牛所產(chǎn)牛奶樣本低[3]。

表1 患乳房炎奶牛奶頭與正常高產(chǎn)奶牛奶頭擦拭樣本序列信息及多樣性指數(shù)

表2 患乳房炎奶牛所產(chǎn)牛奶與正常高產(chǎn)奶牛牛奶樣本序列信息及多樣性指數(shù)

2.2 微生物群落多樣性分析

使用QIIME軟件對(duì)樣本中的水平上菌群組成進(jìn)行分析，共顯示出10種細(xì)菌類群。乳頭擦拭樣本與牛奶樣本中，占據(jù)分布優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群比例有所差異。特點(diǎn)如下：在乳房擦拭樣本中占據(jù)分布優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌群，按照數(shù)量排布次序分別為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門，這四種細(xì)菌類群在所有樣本中均有體現(xiàn)，但各自占比不盡相同。經(jīng)過詳細(xì)比對(duì)可知，在HB1樣本中梭桿菌門含量最高，占比率達(dá)47%；變形菌門在所有牛奶樣本中占比最高，處于2、3位的分別是厚壁菌門和放線菌門。而在HB9樣本中，含量最高的細(xì)菌類群為厚壁菌門和變形菌門?？傮w來(lái)看，變形菌門的含量最高。如表3所示，為11個(gè)奶頭擦拭樣本中分列前兩位的細(xì)菌類群及占比量。如表4所示，為7個(gè)牛奶樣本中分列前兩位的細(xì)菌類群及占比量。

表3 11個(gè)奶頭擦拭樣本中分列前兩位的細(xì)菌類群及占比量

表4 7個(gè)牛奶樣本中分列前兩位的細(xì)菌類群及占比量

2.3 基于最終結(jié)果的討論分析

根據(jù)上述分析可知，奶牛乳房表面含有的微生物與牛奶中的微生物無(wú)論是種類還是數(shù)量均有較大差距。通過對(duì)其他文獻(xiàn)資料研究分析可知，牛奶中的微生物構(gòu)成符合奶牛乳房整體的細(xì)菌群落分布。奶牛一旦患有乳房炎，其內(nèi)外微生物組成均會(huì)發(fā)生顯著改變，而內(nèi)、外源病原菌均會(huì)誘發(fā)疾病。

3 結(jié)語(yǔ)

將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于奶牛乳房炎檢測(cè)，通過觀察其微生物群落結(jié)構(gòu)，探索其共處方式和規(guī)律，明確其獲取營(yíng)養(yǎng)成分及代謝類型，同時(shí)結(jié)合其多樣性及在不同“位置”的分布情況，有助于判斷該病的誘因，不僅可以制定針對(duì)性的治療方案，還能為后續(xù)的防治工作提供準(zhǔn)確的依據(jù)[1]。通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，將來(lái)自不同“位置”的樣本進(jìn)行對(duì)比，能夠清楚看到其內(nèi)微生物的分布情況，從而根據(jù)客觀事實(shí)做出精確判斷。通過結(jié)果對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，此種方式精確、客觀，準(zhǔn)確性較高，能夠?qū)σl(fā)疾病病原菌的源頭進(jìn)行追溯，不僅能夠制定針對(duì)性治療方案，還能夠探知其影響范圍，從而為后續(xù)預(yù)防工作提供參考。