俞瑩瑩，趙彥，譚朝文，鄭玉嬋

南京體育學(xué)院運動健康學(xué)院，江蘇 南京 210000

糖尿病是慢性內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，常易引發(fā)“慢性低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)”。骨骼肌是機體慢性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要部分，藥物和運動干預(yù)能夠有效改善骨骼肌炎癥反應(yīng)[1-2]。單純運動干預(yù)對部分長期患糖尿病的患者的療效不穩(wěn)定[3]，而單純二甲雙胍藥物干預(yù)易引發(fā)高乳酸血癥和高酮癥等不良反應(yīng)[4-5]，兩者結(jié)合可起到有益的疊加效果，二甲雙胍結(jié)合運動干預(yù)是必行的有效治療方案[6]。二甲雙胍聯(lián)合運動干預(yù)相對單純二甲雙胍或單純有氧干預(yù)可更有效的降低血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）炎癥因子水平,改善血管炎癥反應(yīng)[7]。二甲雙胍抗阻聯(lián)合干預(yù)在降低體脂含量、提高基礎(chǔ)代謝方面的效果優(yōu)于單純二甲雙胍組和抗阻組[8]。有氧運動、抗阻運動能通過改善血脂代謝，調(diào)控腫瘤壞死因子TNF-α、白介素6的表達(dá)干預(yù)糖尿病患者的血糖，緩解慢性炎癥反應(yīng)，但這兩種運動方式中哪一種對已有二甲雙胍干預(yù)的糖尿病動物模型，降低血糖的效果更明顯還有待研究。

該研究通過對二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠施以不同運動訓(xùn)練，探討不同運動訓(xùn)練結(jié)合二甲雙胍對糖尿病小鼠血糖、血脂代謝變化、骨骼肌炎性反應(yīng)的影響，推測可能存在的降糖機制，為進一步選擇最佳聯(lián)合干預(yù)方案治療糖尿病提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

6～8周齡清潔級雄性C57BL/ks db/db小鼠24只。分籠飼養(yǎng)，室溫控制在20～24℃，相對濕度控制在50%～70%，自由攝食和飲水，12/12 h光照，通風(fēng)流暢。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為二甲雙胍對照組（C，n=8）、抗阻運動干預(yù)組（P，n=8）和有氧運動干預(yù)組（O，n=8）。所有小鼠飼喂高脂飼料（基礎(chǔ)飼料54.6%，豬油16.9%，蔗糖14%，酪蛋白10.2%，預(yù)飼料2.1%，麥芽糊精2.2%）。

1.2 方法

C組每日灌胃二甲雙胍，劑量為200 mg/（kg·d），給藥體積為0.05 mL/10 g體質(zhì)量[9]。每日監(jiān)控小鼠飲水量，每周調(diào)整1次藥物劑量。O組采用中等強度有氧跑臺，并視小鼠適應(yīng)狀況做適當(dāng)調(diào)整。跑臺坡度為0，15 m/min,60 min/（次·d），4次/周[10]。正式訓(xùn)練前，先進行1周適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，坡度為0，速度由7 m/min逐漸增至15 m/min。以小鼠尾部負(fù)重爬梯方式建立力量運動模型，采用自制爬梯，進行中等強度尾部負(fù)重爬梯訓(xùn)練[11]，梯高1 m，梯間隔1 cm，傾斜度85°，隔天訓(xùn)練，3組/次，每組4個循環(huán)，每次間隔1 min，組間隔2 min。第1周為不負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練，第2周起始負(fù)重負(fù)荷為自身體質(zhì)量的30%，隨后逐漸遞增至適合的負(fù)重重量、爬梯重復(fù)次數(shù)及每組時間間隔。運動訓(xùn)練組藥物劑量與給藥方法同藥物對照組。

1.3 取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h處死實驗動物，處死前12 h禁食。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g），斷頭取血。取右側(cè)股四頭肌外側(cè)頭，置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖 每周用羅氏便攜血糖儀與羅氏血糖試紙測定大鼠FBG空腹血糖值。

1.4.2 血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量測定 采用相應(yīng)試劑盒檢測，以上指標(biāo)檢測均按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 右側(cè)股四頭肌TNF-α、IL-6相對含量測定 取股四頭肌約50 mg冰上剪碎置于研磨管中，加入0.35 mL裂解液，OMINI Besd Ruptor 24型磁珠勻漿儀勻漿，12 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)上清液于離心管中，BCA法測定蛋白濃度后變性。蛋白變性并調(diào)平濃度后即可進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗。采用10%的分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PDVF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，棄掉封閉液加入一抗（anti-TNF-α，1：1 000，Cell Signaling，美國；anti-IL-6,1：1 000，Proteintech，美國;anti-beta Tubulin,1:2 000,Proteintech，美國）4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，10 min/次，根據(jù)一抗加入相應(yīng)稀釋的二抗（anti-rabbit IgG-HRP，1:5 000），室溫避光孵育1.5 h，再次洗膜，滴加ECL，置于Bio-Rad Chemidoc XRS+曝光（Bio-Rad，美國），用圖像分析軟件Image LabTM Software進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料的表達(dá)方式為（），采用單因素方差分析（one way-ANOVA）及t檢驗，采用Pearson相關(guān)分析進行兩變量間的相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白印跡法用Image-Lab進行分析，統(tǒng)計圖表用GraphPad Prism 8制作。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血糖水平對比

訓(xùn)練后，P組和O組血糖均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。8周訓(xùn)練后，與C組相比，P組、O組血糖顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且O組顯著低于P組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 3組小鼠訓(xùn)練前后空腹血糖對比

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與C組比較；#P＜0.05，與P組比較；與干預(yù)前比較△P＜0.05，△△P＜0.01

時間 C組 P組 O組訓(xùn)練前訓(xùn)練后17.54±3.92 20.41±2.88 18.74±4.75（14.91±1.41）**△20.83±2.42（13.04±1.40）**△△#

圖1 各組小鼠干預(yù)前后空腹血糖含量

2.2 3組小鼠血液中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量對比

與C組相比，P組小鼠TC含量顯著降低，HDL-C含量顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），O組TG含量顯著降低，HDL-C含量極顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。O組較P組HDL-C含量顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 3組TC、TG、HDL-C、LDL-C含量

表2 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對比[（），mmol/L]

表2 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C含量對比[（），mmol/L]

注：與C組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與P組比較P#＜0.05

指標(biāo) C組 P組 O組TC TG HDL-C LDL-C 7.03±0.79 0.99±0.22 2.51±0.53 0.91±0.15（6.27±0.51）*0.94±0.30（3.01±0.49）*0.81±0.21 6.67±0.82（0.62±0.12）**#（3.57±0.21）**#0.86±0.07

2.3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

TNF-α和IL-6在3組db/db小鼠右側(cè)股四頭肌中均有表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，8周干預(yù)后，P組和O組均能提高IL-6的表達(dá)，且O組更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。P組、O組TNF-α的表達(dá)均有不同程度的下降，但與C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 3組小鼠IL-6、TNF-α的表達(dá)

表3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

表3 3組小鼠骨骼肌中TNF-α、IL-6含量對比

注：與C組比較P*＜0.05，P**＜0.01

項目 C組 P組 O組IL-6蛋白表達(dá)TNF-α蛋白表達(dá)0.61±0.12 0.88±0.24（0.89±0.14）*0.79±0.08（1.00±0.07）**0.77±0.13

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，8周有氧或抗阻運動均可以明顯降低二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠血糖水平，一定程度上改善血脂代謝；同時，有氧運動組能顯著抑制炎癥反應(yīng)。長期運動聯(lián)合藥物干預(yù)的糖尿病動物模型具有顯著控制血糖和調(diào)節(jié)血脂代謝作用，其中有氧運動聯(lián)合組效果更為顯著，且能更有效的抑制骨骼肌炎癥反應(yīng)。

3.1 不同運動對二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠血糖的影響

高血糖現(xiàn)象是2型糖尿病的基本特征，通過合理用藥及適當(dāng)?shù)腻憻?，能夠控制糖尿病患者的血糖[12]。8周干預(yù)后，聯(lián)合運動組小鼠血糖與單純藥物對照組相比均顯著降低，且有氧組降低血糖的效果更加明顯。近年來研究發(fā)現(xiàn)更多對胰島素敏感性有益的適應(yīng)性變化，長期的有氧運動可以增加毛細(xì)血管密度，可以提高葡萄糖向肌肉輸送的效率，從而實現(xiàn)更大的運輸，而阻力訓(xùn)練卻沒有達(dá)到相應(yīng)的效果[13]。氧化型肌纖維比酵解型肌纖維，在肌糖原消耗量較少的情況下可引起葡萄糖轉(zhuǎn)運速率較高增加。而有氧運動與抗阻訓(xùn)練相比可更多地動員氧化型肌纖維[14]，因而在藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合有氧運動干預(yù)對糖尿病小鼠空腹血糖影響更為顯著?？梢?，8周不同運動均可以降低二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠血糖水平，且有氧運動效果更佳。

3.2 不同運動對二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠血脂代謝的影響

2型糖尿病患者通常伴有血脂紊亂，血脂指標(biāo)是衡量2型糖尿病患者重要指標(biāo)之一。該研究發(fā)現(xiàn)有氧或抗阻運動對二甲雙胍干預(yù)的糖尿病小鼠血脂代謝都有一定的改善作用，其中抗阻運動組降低TC的作用更加明顯，而有氧運動組可以更有效地降低TG、提高HDL-C，對HDL-C的影響最為顯著。糖尿病患者普遍存在胰島素抵抗，胰島素抵抗時，進行脂代謝調(diào)節(jié)的血漿脂蛋白酯酶活性下降，進而使脂解加強，游離脂肪酸FFA釋放增多。最終由于過多的FFA以TG的形式在非脂肪組織中過度沉積，進而造成對該組織的損傷[15]。運動能有效增加肌肉和脂肪組織內(nèi)脂蛋白酶的活性,從而促進肌肉攝取和利用更多的脂肪酸和TC，加快TC和磷脂轉(zhuǎn)移到HDL上，血液中TC和TG水平降低，在很大程度上有效地緩解和預(yù)防TC在動脈管壁的沉積[16]。而耐力運動能更明顯地使血漿HDL-C水平升高[17]，與該研究結(jié)果一致，有氧運動組的HDL-C明顯高于另外兩組，提示有氧運動組降血脂的作用更加明顯。

3.3 不同運動對二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠炎性反應(yīng)的影響

研究表明，骨骼肌是機體慢性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要部分[18]。有氧運動與二甲雙胍運動聯(lián)合干預(yù)可以不同程度地降低血清炎癥因子水平，說明有氧運動與二甲雙胍聯(lián)合干預(yù)可以改善血管炎癥反應(yīng)[19]。2型糖尿病患者進行康復(fù)訓(xùn)練的研究中發(fā)現(xiàn)抗阻訓(xùn)練可明顯地降低患者體內(nèi)的炎癥水平[20]。但不同運動對二甲雙胍干預(yù)的db/db小鼠骨骼肌炎性因子的影響尚未見報道。該研究選用了促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-6[22]來反映骨骼肌炎癥狀態(tài)。結(jié)果顯示抗阻和有氧運動雖然都能降低TNF-α表達(dá)水平，但影響幅度較小。長期中等運動量的運動可降低機體慢性炎癥，而中小運動量的運動對TNF-α的變化影響不大[21]。表示TNF-α變化不大可能與運動量較小有關(guān)。兩種干預(yù)均能夠不同程度地升高IL-6的表達(dá)，且有氧組效果更為顯著。造成此現(xiàn)象的原因可能是抗阻訓(xùn)練過程中易引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，對體內(nèi)炎性因子水平產(chǎn)生影響[20]。此外，體內(nèi)炎性因子與氧化應(yīng)激存在密切關(guān)系，6周的有氧運動能有效提高T2MD大鼠的抗氧化應(yīng)激能力，從而達(dá)到抗炎的效果[23]。因而，提示在二甲雙胍干預(yù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合有氧運動干預(yù)對糖尿病引起的骨骼肌炎癥有較好的治療效果。

綜上所述，有氧運動能有效改善二甲雙胍干預(yù)的糖尿病小鼠血脂代謝，提高抗炎因子IL-6的表達(dá)，緩解骨骼肌炎癥，降低2型糖尿病小鼠空腹血糖，且降糖效果明顯優(yōu)于抗阻運動，為糖尿病康復(fù)選擇最佳的聯(lián)合干預(yù)方案。