肖鈺潔，高倩雯，王羽維，朱曉佳，陳可塑，劉福明，王榮榮，陳 龍,

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023； 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，金陵醫(yī)院門診部傷口護(hù)理中心，江蘇 南京 210000；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院， 江蘇 南京 210029； 4. 泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇 泰州 225300)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)有11個家族(PDE1-11)，每一個家族有若干個不同基因型及剪接變體，因此有超過100個同工酶。每一個PDE家族呈現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)特定的部位，并表現(xiàn)出獨特的調(diào)節(jié)作用，目前已明確PDE1、 2、 3、 4、 5、 8、 9在心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。磷酸二酯酶(PDEs)具有水解細(xì)胞內(nèi)cAMP-環(huán)磷酸腺苷或/和cGMP-環(huán)磷酸鳥苷的功能，降解細(xì)胞內(nèi)cAMP或/和cGMP，從而終結(jié)這些第二信使所傳導(dǎo)的生化作用。PDEs在人體內(nèi)分布廣泛，生理作用涉及多個研究領(lǐng)域。目前以PDE作為靶點的藥物用于抗心衰藥物開發(fā)越來越受關(guān)注，其中，PDE1, 2, 3水解cAMP及cGMP，PDE4及PDE8僅水解cAMP，PDE5及PDE9僅水解cGMP[1-2]。PDE3[3]、PDE4[4]、PDE5[5]、PDE7[6]等藥理學(xué)作用均有研究報道，而PDE8在體動物研究鮮有報道。

PDE8是對cAMP具有高度的親和力和特異性，研究表明PDE8抑制劑具有廣泛的生理藥理作用。PDE8家族由PDE8A和PDE8B基因編碼組成，PDE8A是一種PDE亞型，主要與線粒體有關(guān)，與cAMP的親和力是PDE4的40-100倍，PDE8A mRNA和蛋白在心肌細(xì)胞中含量豐富。PDE8A在免疫過程中很重要，如T細(xì)胞激活、效應(yīng)器T細(xì)胞粘附、趨化作用[7-9]以及乳腺癌細(xì)胞的運動[10]。PDE8A在睪丸中含量非常豐富，但也存在于人和小鼠的心臟中[11]。最近對PDE8A基因敲除小鼠的研究表明，PDE8A在小鼠心臟的心室肌細(xì)胞中表達(dá)[12]。此外，PDE8抑制劑增加細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度而舒張氣管平滑肌，對哮喘和慢性阻塞性肺等疾病具有潛力。

PDE8B廣泛分布于胞質(zhì)中，據(jù)報道，PDE8B在人類甲狀腺細(xì)胞中含量很高，間接證據(jù)表明它在胰腺細(xì)胞中表達(dá)。由于缺乏選擇性的藥理抑制劑，磷酸二酯酶8B(PDE8)家族的功能在很大程度上尚不清楚。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，PDE8B是治療幾種不同腎上腺疾病的潛在治療靶點。

PDE8合適的抑制劑相對較少，因此研究其功能的藥理學(xué)方法一直受到阻礙。PDE8對廣譜的甲基黃嘌呤類PDE抑制劑如3-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)不敏感。廣泛的PDE抑制劑雙嘧達(dá)莫是唯一已知的抑制PDE8酶的化合物，其對這些酶的抑制作用較弱。但最近發(fā)現(xiàn)其抑制劑PF-04957325，有利于尋找新的藥物研究突破。來自PDE8 基因敲除心臟的心肌細(xì)胞在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的[Ca2+]瞬變、L型Ca2+通道電流(ICa)和Ca2+火花活動中引起更大的增加，這表明PDE8A控制cAMP參與心肌細(xì)胞的Ca2+處理[8]。有趣的是，PDE8A缺失導(dǎo)致RyR通道泄漏，其表現(xiàn)為肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子再充盈的代償性增加[8]。這些效應(yīng)的機(jī)制目前正在研究中。PDE8A缺乏對慢性病理性心臟重構(gòu)和心功能不全的影響也值得進(jìn)一步研究。

雖然PDE8水解cAMP的機(jī)理非常明確，但由于PDE8在心肌細(xì)胞器內(nèi)的分布并不均勻，因此PDE8作用下細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度降低也就不均等，呈現(xiàn)出的心肌功能并不等同cAMP的濃度降低的作用。本研究采用PDE8抑制劑，對心臟血流動力學(xué)的特點進(jìn)行研究，間接分析PDE8可能的作用機(jī)理。通過本研究為判斷PDE8能否作為靶點研發(fā)正性肌力的藥物用于臨床治療心力衰竭提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑PDE8抑制劑PF-04957325購于Glpbio，貨號GC32701，純度大于99.94%； Fluo-4AM購于上海東仁化學(xué)科技有限公司，貨號F312；其它試劑均購于Sigma公司。

1.2 實驗儀器多導(dǎo)生理記錄儀(PowerLab 8/35，澳大利亞AD Instruments公司)；放大器(35-2083 Rev. F Millar)、雙壓力-容積導(dǎo)管(SPR-901型) (美國MILLAR公司)；Langendorff離體心臟灌流裝置(M402173，中國西化儀北京科技有限公司)；灌流給藥系統(tǒng)(美國VC3-8，ALA公司)；Olympus IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；科研級高靈敏致冷CCD (ZYLA-5.5-CL3，英國ANDOR公司)；超高速波長切換裝置(Lambda DG-4，美國Sutter)。

1.3 實驗動物8周齡的成年SD大鼠，♂，體質(zhì)量250 g，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證：SCXK(浙)2019-0002；動物實驗倫理批準(zhǔn)號：202005A045；飼養(yǎng)室內(nèi)12 h明暗周期，溫度(21-26)℃，濕度40%-70%，自由進(jìn)食和飲水。

1.4 濃度設(shè)計經(jīng)大鼠在體預(yù)實驗，選擇PF-04957325劑量能夠引起最大藥效的最低劑量(大約)，最終選擇劑量為0.5 mg·kg-1的PF-04957325進(jìn)行在體實驗。離體心臟收縮力實驗PF-04957325濃度為0.001、 0.01、 0.1和1 μmol·L-1。心肌細(xì)胞鈣釋放實驗在室溫條件下進(jìn)行，為了實驗功能變化最大化并分析其機(jī)理，PF-04957325濃度選擇為1 μmol·L-1。

1.5 在體大鼠壓力-容積環(huán)分析按照本實驗室之前方法[1, 13-14]，用20%烏拉坦(5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。Millar雙壓力導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)位的頸總動脈插入到大鼠體內(nèi)，一個壓力感受器及一個測量血液容積的電導(dǎo)探測器放置于左心室，另一個壓力感受器放置于主動脈。記錄左心室壓力-容積環(huán)以及主動脈壓力。將PF-04957325溶于DMSO (0.3 mL)后腹腔注射，待藥效穩(wěn)定后記錄大鼠加藥后各血流動力學(xué)參數(shù)。實驗結(jié)束后，自頸靜脈推注30%高滲鹽水20-50 μL并取自身血液進(jìn)行容積定標(biāo)。

1.6 離體大鼠心臟左心室收縮力測定大鼠麻醉方法同在體實驗，迅速取心臟置于(0-4) ℃無鈣臺氏灌流液中，使其停搏。離體大鼠心臟掛于已充滿灌流液的Langendorff裝置上，在充氧(95% O2+5% CO2)，溫度為(37.5±0.5) ℃條件下，經(jīng)主動脈逆行灌流，灌流壓為90 cm H2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。將充滿灌流液并排空氣泡的壓力換能器插管，經(jīng)由左心房插入左心室，連接RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)用以記錄左心室收縮曲線。將刺激強(qiáng)度約5 V的一對刺激電極加于離體心臟心房兩側(cè)，刺激心臟以4 Hz固定頻率(即心率240)進(jìn)行起搏。PF-04957325溶于20 mL含鈣灌流液中配制成相應(yīng)濃度(0.001, 0.01, 0.1, 1 μmol·L-1)，灌流給藥。灌流液的組成(mmol·L-1)：NaCl 135，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5，Glucose 10，MgCl21，CaCl21.8，NaOH調(diào)pH至7.3-7.4。

1.7 大鼠左心室心肌細(xì)胞場刺激誘導(dǎo)的鈣釋放首先用含2 g·L-1膠原酶Ⅱ消化心臟獲得單個大鼠心室肌細(xì)胞[14]。細(xì)胞懸液加入鈣熒光指示劑Fluo-4 AM (5 μmol·L-1)于37 ℃避光孵育30 min。使用激光共聚焦顯微鏡激發(fā)細(xì)胞中的Fluo-4發(fā)出熒光，采用空氣冷卻CCD相機(jī)采集并記錄熒光信號。由刺激器通過一對電極將頻率為1 Hz，強(qiáng)度為15 V的刺激加于心肌細(xì)胞兩側(cè)，刺激細(xì)胞收縮并記錄鈣釋放。記錄其曲線作為空白對照，隨后灌流含PF-04957325 (1 μmol·L-1)的灌流液約5 min，再次刺激細(xì)胞并記錄鈣釋放，當(dāng)鈣釋放曲線穩(wěn)定后記錄其曲線作為PF-04957325的效應(yīng)。

1.8 大鼠左心室心肌細(xì)胞咖啡因誘導(dǎo)的鈣釋放分析Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+exchanger, NCX)及質(zhì)膜Ca2+泵(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA)作用加載鈣熒光指示劑Fluo-4 AM的大鼠左心室肌細(xì)胞，用含有1.8 mmol·L-1Ca2+的臺氏液作為細(xì)胞外液灌流，用1 Hz場刺激至少20次，確保肌漿網(wǎng)中Ca2+含量穩(wěn)定。結(jié)束刺激后，噴射咖啡因(Caffeine，20 mmol·L-1)于細(xì)胞表面，誘導(dǎo)出完全的鈣瞬變，此時的鈣瞬變的下降相主要由NCX和PMCA介導(dǎo)，其Ca2+釋放下降相經(jīng)擬合獲得的衰退常數(shù)即為rNCX+PMCA，該常數(shù)反映NCX和PMCA外排鈣于細(xì)胞外的功能。

2 結(jié)果

2.1 PF-04957325對在體大鼠血流動力學(xué)的作用與正常組相比，PF-04957325 (0.5 mg·kg-1，ip)顯著增加左心室搏出功(stroke work，SW)、心輸出量(cardiac output，CO)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、收縮末期壓(end-systolic pressure，Pes)、心率 (heart rate，HR)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、動脈收縮壓(systolic pressure，SBP)；降低收縮末期的容積(end-systolic volume，Ves)、舒張末期的容積(end-diastolic volume，Ved)、動脈舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、外周血管阻抗(arterial elastance，Ea)。其中，Ea=Pes/SV，即外周動脈系統(tǒng)中單位容量變化帶來的壓力變化，其值越大血管阻力越大。實驗結(jié)果及代表性P-V loop見Tab 1, Fig 1及Fig 2。

Tab 1 Effects of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip) on left ventricular and aortic hemodynamic parameters of anesthetized normal rats n=5)

2.2 PF-04957325對大鼠離體心臟收縮力的作用為了排除神經(jīng)體液因素的影響，大鼠離體心臟灌流實驗被用于分析PF-04957325對心臟的直接作用。離體心臟實驗除采用心臟自發(fā)節(jié)律(non-pacing)外，還采用固定頻率刺激法(pacing)觸發(fā)離體心臟產(chǎn)生恒定頻率收縮，排除心率對收縮力的影響。Pacing法采用4 Hz刺激頻率，該頻率形成的心率為240次/min，與Non-pacing法的心率相近。結(jié)果表明：PF-04957325 (0.001、 0.01、 0.1、 1 μmol·L-1)濃度依賴性地增加大鼠左心室non-pacing及pacing法的左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)及左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)；在non-pacing狀態(tài)下，心率出現(xiàn)濃度依賴性降低。見Tab 2及Fig 3。

Fig 1 Representative simultaneously recorded curves of rat left ventricular pressure, volume and aortic blood pressure (A), and derived left ventricular pressure-volume relationship (B) before and after administration of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip)

Tab 2 Effects of PF-04957325 on left ventricular contractility and heart rate in isolated rat hearts in non-pacing and pacing modes n=5)

Fig 2 Simultaneously recorded curves of rat left ventricular pressures (A) and aortic blood pressures (B) before and after administration of PF-04957325 (0.5 mg·kg-1, ip)

2.3 PF-04957325對大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣釋放的作用鈣釋放曲線分為快速上升相及下降相，上升相主要由RyR2通道開放引起肌漿網(wǎng)鈣釋放至胞質(zhì)，其幅值的大小本質(zhì)上取決于肌漿網(wǎng)與胞質(zhì)之間Ca2+濃度梯度。下降相主要由肌漿網(wǎng)鈣泵2a (sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase-2a, SERCA2a)回吸收鈣至肌漿網(wǎng)，以及通過膜NCX及PMCA外排至細(xì)胞外引起的。其中SERCA2a的回吸收介導(dǎo)了快速下降相，其回吸收鈣的速率常數(shù)為α，NCX和PMCA外排鈣于細(xì)胞外介導(dǎo)了緩慢下降相，速率常數(shù)為β。實驗結(jié)果表明：PF-04957325(1 μmol·L-1)增加大鼠左心室鈣釋放幅值從正常對照組的100.00±63.01增加到PF-04957325組的119.01±79.87

Fig 3 Representative left ventricular developed pressure curves from isolated rat hearts in non-pacing and pacing modes before and after perfusion of PF-04957325 (0.001, 0.01, 0.1, 1 μmol·L-1)

2.4 PF-04957325對大鼠左心室心肌細(xì)胞NCX及PMCA的作用本實驗在場刺激誘導(dǎo)鈣釋放的基礎(chǔ)上，結(jié)合高濃度咖啡因誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)RyR2完全開放，使肌漿網(wǎng)與胞質(zhì)之間的鈣濃度梯度消失，從而間接廢除肌漿網(wǎng)SERCA2a的功能，實現(xiàn)胞質(zhì)鈣濃度下降由NCX及PMCA外排細(xì)胞外所介導(dǎo)。實驗結(jié)果表明，PF-04957325 (1 μmol·L-1)未明顯改變NCX及PMCA聯(lián)合活性速率常數(shù)(rNCX+PMCA)[從對照組的0.144±0.064到PF-04957325組的0.143±0.081, 兩組均為n=12)。線見Fig 5。

Fig 4 Representative curves of field stimulation induced Ca2+ transients and representative curve fittings by two exponential equation

Fig 5 Effect of PF-04957325 (1 μmol·L-1) on decaying rate constant of Ca2+ extrusion by NCX plus PMCA (rNCX+PMCA)

2.5 PF-04957325 增加了p-PLB Ser-16和p-PLB Thr-17磷酸化，而對RyR2磷酸化沒有明顯影響PF-04957325(1 μmol·L-1)明顯增加p-PLB Ser-16 [從對照組的(100±45.8)% 增加到PF-04957325組的(345±112.5)% ,P<0.05,n=6] 和p-PLB Thr-17[從對照組的(100±16.3)% 增加到PF-04957325組的(165±39.3)%,P<0.05,n=6]的磷酸化水平?？偟腜LB 水平[從對照組的(100±59.7)% 到PF-04957325組的(89±41.8)%,P>0.05,n=6] 沒有明顯影響。然而，PF-04957325 (1 μmol·L-1)對p-RyR2Ser2808 [從對照組的(100±44.7)%到PF-04957325組的(116± 53.8)%,P>0.05,n=6]和p-RyR2Ser-2814 [從對照組的(100±29.53)%到PF-04957325組的(114±16.9)%，P>0.05,n=6] 以及總的RyR2 水平[從對照組的(100±56.0)%到PF-04957325組的(116±48.4)%,P>0.05,n=6]沒有明顯影響。見Fig 6。

3 討論

本研究從整體、離體心臟及細(xì)胞水平闡明了PDE8抑制劑PF-04957325對正常大鼠血流動力學(xué)作用及其細(xì)胞的作用機(jī)理，雖然沒有研究其心臟病理模型條件下的作用，但為病理模型研究提供了理論基礎(chǔ)。同時也間接提供了PDE8對血流動力學(xué)的作用及其機(jī)理。

雙壓力-容積環(huán)實驗表明，PDE8抑制劑PF-04957325具有正性肌力作用，其主要收縮力指標(biāo)如搏出功、每搏輸出量及射血分?jǐn)?shù)等顯著增加。而涉及到壓力-容積環(huán)的左心室血流量與外周血管的回心血量有關(guān)，回心血量與外周血管的擴(kuò)張程度外周阻力有關(guān)，結(jié)果PF-04957325表明增加收縮壓、降低舒張壓及血管外周阻力。此外，離體心臟實驗同樣表明PF-04957325具有正性肌力作用，表明PF-04957325的這種作用是不依賴于神經(jīng)體液。然而，PF-04957325對心率的作用，在體與離體表現(xiàn)相反的作用，PF-04957325對心臟的直接作用(離體心臟實驗)是減慢心率；而在體實驗條件下，PF-04957325顯著增加心率。在體實驗條件下，PF-04957325增加心率可能是降低血管外周阻力導(dǎo)致的交感神經(jīng)活性增強(qiáng)，但這需要進(jìn)一步實驗確認(rèn)。

Fig 6 Representative Western blot of phosphorylated expressions of PLB (A) and RyR2(B) induced by PF-04957325 (1 μmol·L-1)

基于正性肌力作用與胞質(zhì)鈣釋放有著密切關(guān)聯(lián)，本研究采用鈣釋放實驗探討PF-04957325正性肌力的作用機(jī)理。鈣釋放直接影響心肌的收縮與舒張，受到多種因子和酶的調(diào)控。鈣從肌漿網(wǎng)中釋放到胞質(zhì)，必須具備兩個條件，一是肌漿網(wǎng)鈣濃度高于胞質(zhì)，二是鈣釋放的通道RyR2受體通道突然開放。隨后舒張期鈣被肌漿網(wǎng)SERCA2a逆濃度耗能回吸收到肌漿網(wǎng)，還有少量鈣經(jīng)過細(xì)胞膜上NCX及PMCA外排出細(xì)胞。RyR2受體及SERCA2a功能受多種酶的調(diào)控，其中包括蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)[15]及鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)[16]。在場刺激誘導(dǎo)的鈣釋放實驗中，PF-04957325增加肌漿網(wǎng)的鈣釋放幅值，該作用是肌漿網(wǎng)SERCA2a活性增加而導(dǎo)致肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣濃度梯度增加。

Western blot實驗表明PF-04957325增加受磷蛋白(PLB)的16位絲氨酸及17位蘇氨酸磷酸化水平，對蘭尼堿受體(RyR2)的2808位絲氨酸及2814位絲氨酸磷酸化水平無顯著性變化。PDE8對cAMP具有高度的親和力和特異性，PF-04957325作為PDE8的抑制劑，導(dǎo)致cAMP胞內(nèi)濃度增加。理論上應(yīng)該導(dǎo)致PLB的16位絲氨酸及RyR2的2808位絲氨酸磷酸化水平增加，而PLB 17位蘇氨酸是由CaMKII介導(dǎo)的，增加cAMP并不能夠?qū)е翽LB 17位蘇氨酸直接磷酸化。這些與實驗結(jié)果相矛盾，可能的解釋是胞內(nèi)的PDE8的分布并不均勻，表現(xiàn)出使用PF-04957325后，胞內(nèi)的cAMP并非在每一個細(xì)胞器內(nèi)濃度均增加。其外，PF-04957325也可能抑制其它蛋白酶。

綜上所述，PDE8抑制劑PF-04957325通過增加PLB磷酸化水平提高SERCA2a活性，發(fā)揮其對大鼠心臟正性肌力作用，降低外周血管阻力，從而導(dǎo)致舒張壓降低。