曹旭，李小科，2，糟小賓，3，楊先照，2，張嘉鑫，李志國，杜宏波，2，葉永安，2＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院北京100700；2.北京中醫(yī)藥大學肝病研究所北京100700；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部/北京市重點實驗室北京100700；4.北京市豐臺中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院北京100072）

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是目前全球范圍內(nèi)公認的難治性惡性腫瘤之一。近一個世紀以來，發(fā)病率顯著升高[1]。據(jù)2018年全球腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌占癌癥死亡原因的8.2%，排名第4位[2]。2019年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年肝癌新發(fā)病人數(shù)37萬，是我國第4位常見惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因，嚴重威脅著人類的生命和健康[3,4]。我國約80%肝癌由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染引起，致使HBV相關肝癌成為我國重大公共衛(wèi)生問題之一，但其發(fā)病機制尚未完全闡明[4]。在傳統(tǒng)的HBV相關肝癌治療上，慢性HBV感染與肝臟惡性腫瘤被視作存在因果關系但又相對獨立的兩個方面，因此其治療也被劃分為針對HBV的長期積極抗病毒治療，以及介入、靶向和手術(shù)等針對肝癌的治療?，F(xiàn)有的西醫(yī)藥治療方案大致屬于“組合”方案而非“綜合”方案。中醫(yī)藥治療由于其辨證論治的屬性與對疾病的總體觀，可發(fā)揮綜合作用，在控制HBV慢性感染背景下的疾病進展，包括阻斷癌前病變、彌補單純西醫(yī)治療的局限性、延長生存期及改善生活質(zhì)量等方面具有獨特優(yōu)勢。但由于中藥作用網(wǎng)絡的高度復雜性，對于藥物靶點的探索以及有效藥物的篩選是當前的重要挑戰(zhàn)。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學技術(shù)，通過對GEO數(shù)據(jù)庫中包含HBV感染的肝癌組織和癌旁組織數(shù)據(jù)進行分析，分別找到兩個數(shù)據(jù)集的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）并取重疊DEGs進行后續(xù)分析。通過多種數(shù)據(jù)分析軟件及模型，對重疊DEGs進行篩選并得到HBV相關肝癌中的關鍵基因與潛在藥物，初步揭示了關鍵基因之間表達相關性及調(diào)控機制。綜上所述，本研究為臨床HBV相關肝癌的中、西醫(yī)治療和生存預后判斷提供了新的靶點與思路。

1 材料與方法

1.1 材料

美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基 因 表 達 數(shù) 據(jù) 庫（Gene Expression Omnibus Database，GEO）[5]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中HBV相關HCC數(shù)據(jù)集，包括GSE121248[6]與GSE49713數(shù)據(jù)集[7]。GSE121248數(shù)據(jù)集（Platforms：GPL570）有107個樣本（37個非肝癌組織，70個肝癌組織），GSE49713數(shù)據(jù)集（Platforms：GPL11269）有10個樣本（5個非肝癌組織，5個肝癌組織）。

1.2 方法

1.2.1 篩選基因表達譜芯片的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）

以在線分析工具GEO2R對GSE121248和GSE49713數(shù)據(jù)集進行分析，兩組條件均設置為P<0.01，|logFC|≥1.5，剔除數(shù)據(jù)集中沒有注釋的探針及同時對應多個基因的探針。若多個探針對應同一個基因則取絕對值最大值，對獲得的DEGs取交集，進行韋恩圖繪制[sangerbox(http://sangerbox.com/)]。

1.2.2 DEGs功能注釋（Gene Ontology，GO）和通路富集 分 析（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome，KEGG）

以DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫[8-9]（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）對DEGs進行GO及KEGG分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。GO分析包含生物學過程（Biological Process，BP）、分 子 功 能（Molecular Function，MF）和細胞組分（Cellular Component，CC）。氣泡圖繪制于R包ggplot2(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)。

1.2.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡、篩選hub基因

通過String 11.0數(shù)據(jù)庫[10]（String-db.org）對DEGs進行蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建，設置medium confidence>0.4的蛋白互作關系導入Cytoscape 3.8.0軟件[11]，以MCODE插件篩選hub基因，設置條件degree cutoff:2，cluster finding:haircut，node score cutoff:0.2，k-core:2。

1.2.4 獲取并驗證關鍵基因

通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫[12]（kmplot.com/analysis/）對篩選得到的hub基因進行再篩選，在111位HBV感染的肝癌患者數(shù)據(jù)里進行驗證，得到總體生存（Overall Survival，OS）有意義的關鍵基因，設置條件為liver cancer；auto select best cutoff；survival：OS；follow up threshold：all；risk factors：alcohol consumption：none；hepatitis virus：yes，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。以腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的分析網(wǎng)站UALCAN數(shù)據(jù)庫[13]（http://ualcan.path.uab.edu/）對關鍵基因在421位HCC患者數(shù)據(jù)里進行驗證，設 置 條 件 為TCGA analysis；gene symbol；liver hepatocellular carcinoma；explore；expression。

1.2.5 關鍵基因的分析

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫[14]（www.cbioportal.org）對關鍵基因進行基因突變、表達相關性及生存預后分析。關鍵基因表達相關性通過String 11.0數(shù)據(jù)庫進行可視化，設置條件為liver；liver hepatocellular carcinoma（TCGA，F(xiàn)irehose legacy，442 samples）；oncoprint；mutual exclusivity；survival。

1.2.6 篩選關鍵基因的潛在藥物

通過比較毒物遺傳學數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database,CTD)[15]（http://ctdbase.org/）篩選對關鍵基因具有潛在作用的化合物，設置條件為search；chemical-gene Interaction query；decrease；gene equals protein，選擇能夠降低關鍵基因蛋白活性或表達量的潛在化合物。利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制靶基因與潛在化合物的關系圖，以Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡相關屬性，得到關鍵基因和化合物。

2 結(jié)果

2.1 分析流程和GSE121248與GSE49713數(shù)據(jù)集中DEGs分析

本研究中HBV相關肝癌關鍵基因及化合物的相關分析流程，如圖1（A）所示。首先，通過GEO2R工具對GEO數(shù)據(jù)庫GSE121248與GSE49713數(shù)據(jù)集中DEGs進行分析，其中GSE121248數(shù)據(jù)集中得到240個DEGs，GSE49713數(shù)據(jù)集中得到1285個DEGs，同時兩個數(shù)據(jù)集取交集，共得到93個重疊DEGs，并繪制韋恩圖，如圖1（B）所示。

圖1 分析流程和GSE121248與GSE49713數(shù)據(jù)集中DEGs分析

2.2 重疊DEGs的GO與KEGG通路富集分析

通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對93個重疊DEGs進行GO和KEGG通路富集，分析結(jié)果如圖2（A-D）所示，具體見附表1。其中，GO富集BP結(jié)果顯示重疊DEGs主要富集在氧化還原、蛋白質(zhì)水解和有絲分裂核分裂等29個過程，MF重疊結(jié)果與血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)合等11個功能相關，CC重疊結(jié)果顯示主要集中在細胞外小體、細胞外區(qū)域和細胞外隙等8個部分；KEGG通路富集表明重疊基因主要集中在代謝途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝和色氨酸代謝3條通路。以上結(jié)果表明篩選得到的相關基因與HBV肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

表1 重疊DEGs的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

圖2 重疊DEGs的GO與KEGG通路富集分析

2.3 重疊DEGs的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建和hub基因篩選

通過String 11.0數(shù)據(jù)庫對93個重疊DEGs進行PPI網(wǎng)絡可視化構(gòu)建，觀察到密切交互區(qū)域，如圖3（A）所示。其中密切交互區(qū)域中存在13個hub基因網(wǎng)狀連接，如圖3（B）所示，分別為：ANLN、CDK1、CDKN3、EZH2、FAM83D、KIF20A、PTTG1、TOP2A、UBE2T、ZWINT、NEK2、NUSAP1和PRC1。

圖3 重疊DEGs的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建和hub基因篩選

2.4 HBV相關肝癌關鍵基因的確定和驗證

基于Hub基因篩選結(jié)果，進一步分析這些基因與HBV相關肝癌患者總體生存的相關性。結(jié)果表明，表達值對HBV相關肝癌患者預后預測有意義的基因分別為ANLN、CDK1、CDKN3、EZH2、FAM83D、KIF20A、PTTG1、TOP2A、UBE2T和ZWINT，如圖4（A-J）所示。對預后有意義的關鍵基因之間的相關性進行分析，結(jié)果表明10個關鍵基因之間存在一定表達相關性，如圖4（K）所示，表達相關性存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）的組別如附表2所示。進一步通過UALCAN數(shù)據(jù)庫對這10個關鍵基因進行驗證，發(fā)現(xiàn)相比于非肝癌組織，這些關鍵基因在肝癌組織中均存在高表達（P<0.001），如圖5（A-J）所示，并與腫瘤分期有一定的相關性，對患者預后不利，如圖6（A-K）所示。以上結(jié)果提示10個關鍵基因在HBV相關肝癌中發(fā)揮重要作用。

圖5 HBV相關肝癌關鍵基因的確定和驗證

圖6 HBV相關肝癌關鍵基因的確定和驗證

表2 關鍵基因之間的表達相關性

圖4 關鍵基因的預后和表達相關性分析

2.5 關鍵基因在肝癌中的突變及預后分析

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫對關鍵基因進行基因突變分析，結(jié)果表明，在肝癌組織中這10個關鍵基因均有一定的突變發(fā)生率，如圖7（A）所示。將10個基因均無突變樣本歸為一組（unaltered group），將基因突變樣本歸為一組（altered group）并分析對肝癌患者預后的影響。結(jié)果表明，基因突變組肝癌患者的總體生存率和無病生存（disease free survival，DFS）率相較于無突變組更低，且存在統(tǒng)計學意義（P<0.001），如圖7（BC）所示。以上結(jié)果提示，篩選得到的關鍵基因表達及預后相關性與基因突變有關，是一項重要的調(diào)控機制。

圖7 關鍵基因在肝癌中的突變及預后分析

2.6 HBV相關肝癌潛在治療藥物篩選

根據(jù)上述結(jié)果，關鍵基因高表達的患者預后較差，所以減少關鍵基因表達或活性的化合物可能存在治療作用。通過CTD數(shù)據(jù)庫得到減少關鍵基因表達量或活性的潛在作用化合物，見附表3。以Cytoscape 3.8.0軟件繪制關鍵基因和潛在化合物的互作圖，Analyse Network得到互作圖的網(wǎng)絡信息，根據(jù)網(wǎng)絡連接密度來設置關鍵基因圖標的大小，圖標的大小與Degree值成正比。如圖8所示，排名前三位的基因是CDK1、TOP2A、EZH2；得到作用于2個以上關鍵基因的化合物是三氧化二砷、白藜蘆醇、紅豆堿、玫瑰樹堿、多柔比星、氯化鎘、甲基苯丙胺、帕博西尼、對苯二酚、吡唑嵌蒽酮、雷公藤甲素、伏立諾他、乙酰半胱氨酸、重鉻酸鉀、二乙基己基鄰苯二甲酸和亞砷酸鈉。以上結(jié)果表明通過結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，能夠篩選得到多種關鍵基因、靶點及相應中醫(yī)藥，具體的作用調(diào)控、作用機制需要進一步研究。

圖8 HBV相關肝癌潛在治療藥物篩選

表3 關鍵基因和相關化合物

3 討論

全球每年因HBV感染相關疾病死亡人數(shù)將近88.7萬，其中HBV相關肝癌約占38%。在我國，HBV導致的HCC比例高達84%[16]。目前HBV相關肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究方興未艾，但仍缺乏針對性治療靶點、治療藥物及預后評估的有效標記物。本研究通過臨床樣本數(shù)據(jù)挖掘與生物信息學分析相結(jié)合的方式，篩選得到在HBV相關肝癌與癌旁中存在表達差異的93個基因，在HBV相關肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的10個關鍵基因，并完成了針對關鍵基因的潛在治療化合物的預測，為HBV相關肝癌的治療及預后評估提供了新的靶點與思路。

在發(fā)病機制方面，GO富集分析BP結(jié)果提示篩選得到的93個DEGs參與了氧化還原、蛋白質(zhì)水解和有絲分裂核分裂等多個過程，均與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關。近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境多處于缺氧狀態(tài)，Warburg效應提示糖酵解是腫瘤細胞的主要能量來源[17]。缺氧誘導因子在缺氧條件下轉(zhuǎn)錄活性增強，導致參與細胞功能的相關基因表達增強，從而促進體內(nèi)細胞代謝、增殖和遷移[18]。CC結(jié)果顯示篩選得到的93個DEGs集中在細胞外小體、細胞外區(qū)域和細胞外隙等，提示HBV相關肝癌微環(huán)境中細胞間交互可能存在重要意義。KEGG通路富集結(jié)果表明篩選得到的93個DEGs主要集中在代謝途徑，這與GO富集分析MF結(jié)果具有一致性。這些差異基因在HBV相關肝癌中發(fā)揮的作用需要進一步驗證。

在治療靶點及預后標志物方面，通過PPI網(wǎng)絡互作分析得到了13個hub基因。利用TCGA-HCC數(shù)據(jù)對這些hub基因表達進行肝癌生存分析發(fā)現(xiàn)，ANLN、CDK1、CDKN3、EZH2、FAM83D、KIF20A、PTTG1、TOP2A、UBE2T和ZWINT這10個基因?qū)BV相關肝癌患者的總體生存均有影響，在肝癌組織中基因高表達組患者的預后更差（P<0.05）。相比于非肝癌組織，這10個基因在肝癌組織中的表達均顯著上調(diào)（P<0.001）且與肝癌分期有一定相關性，這與既往文獻報道結(jié)果相一致[19-28]。通過進一步對關鍵基因的表達和突變情況分析發(fā)現(xiàn)，這10個基因在肝癌組織中存在一定的表達相關性，且均有突變發(fā)生。針對突變樣本與非突變樣本的預后分析結(jié)果表明，關鍵基因突變不利于肝癌患者的預后，而突變往往帶來基因表達與蛋白活性的改變，提示靶向這些關鍵基因表達及蛋白活性藥物研究的重要性。

在潛在藥物篩選方面，以關鍵基因與潛在化合物的網(wǎng)絡互作圖得到連接度最高的前3個基因，包括CDK1，TOP2A，EZH2。篩選得到作用于2個以上關鍵基因的目標化合物，如三氧化二砷、白藜蘆醇、紅豆堿、雷公藤甲素、玫瑰樹堿等?；谀[瘤藥物敏感性基因組學數(shù)據(jù)庫（Genomics of Drug Sensitibity in Cancer，GDSC）[29]的分析結(jié)果提示EZH2基因突變會顯著增加Afuresertib、Venetoclax藥物治療腫瘤的敏感性。研究表明，EZH2表達與HBV病毒的轉(zhuǎn)錄和復制密切相關，并且在HBV相關肝癌中發(fā)揮較為重要的作用[30]。因此，可以降低EZH2表達量的穿心蓮內(nèi)酯可能成為針對HBV相關肝癌的潛在治療藥物。除此之外，針對CDK1基因為靶點的黃芩提取物、水飛薊賓、槲皮素、姜黃素、芹菜素、木犀草素、金雀異黃素及葫蘆素I等藥物，以及針對TOP2A基因為靶點的隱丹參酮、熊果酸、金絲桃素、乳香酸、薄荷醇、飛燕草色素、齊墩果酸、花青素B2及楊梅黃酮均為HBV相關肝癌潛在治療藥物。這些藥物與HBV及HBV相關肝癌的相互作用及機制需要進一步研究。

續(xù)表

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目前我國仍存在很高比例的HBV感染肝癌患者，這也是我國肝癌防治策略不同于西方國家的重要考量?；谶@一重要而普遍的始動因素，我們在對肝癌進行新藥篩選的過程中，應將肝癌相關基因調(diào)控及分子通路的分析融入到HBV感染的背景中加以分析。在中醫(yī)治療中強調(diào)“整體觀念”“辨證論治”，常采用辨病與辨證相結(jié)合的策略，對HBV相關肝癌的治療也確非“抗病毒”與“抗腫瘤”的簡單疊加，從藥物的選擇上亦是如此。基于本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)涵可能與HBV相關肝癌的特殊調(diào)控機制相關，是值得進一步探索、發(fā)掘的方向。從服務新藥開發(fā)的角度來看，上述研究對優(yōu)化處方，明確臨床有效處方的起效機制、相關靶點，聚焦關鍵藥物，以及建立可供實驗進一步證實的單體和復方均具有一定指導意義；另一方面對HBV相關肝癌及肝癌前病變過程中，藥物治療的療效評價和結(jié)局預測提供參考。因此，本研究利用生物信息學方法篩選出HBV相關肝癌的關鍵基因及潛在的中藥藥物，為后續(xù)HBV相關肝癌發(fā)病機制及治療靶點研究奠定了重要的基礎。