裴陽晴，丁明翠，王 迪，郝長付，姚 武

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001 3)上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心 上海 201901

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種常見的慢性進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺疾病。在IPF過程中，肌成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，可以介導(dǎo)纖維的生成、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積以及組織重塑[1]。肌成纖維細(xì)胞特征性表達(dá)α-SMA，并且具有較高的收縮能力和纖維生成能力；其最常見的來源為肺間質(zhì)的成纖維細(xì)胞[2]。有學(xué)者[3-4]報(bào)道，成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)因素主要為細(xì)胞因子(IL-10、IL-4)、生長因子(TGF-β)、機(jī)械張力等機(jī)械因素以及纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。近年來，隨著學(xué)者們對(duì)基因組研究的深入，越來越多的證據(jù)[5]表明miRNA也參與并調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，主要包括上皮修復(fù)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞活化、肌成纖維細(xì)胞分化等。目前已知的參與調(diào)控成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的miRNA大多是通過靶向調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[6]；但關(guān)于miR-107在肺纖維化疾病中的研究較少，且其在肺纖維化進(jìn)程中的作用尚不清楚。因此，本研究利用TGF-β誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3轉(zhuǎn)分化，檢測細(xì)胞中轉(zhuǎn)分化標(biāo)志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平及miR-107表達(dá)水平，探討miR-107在NIH-3T3轉(zhuǎn)分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料NIH-3T3細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、丙酮酸鈉、非必需氨基酸(北京索萊寶科技有限公司)，抗GAPDH兔多克隆抗體(杭州賢至生物科技有限公司)，抗α-SMA兔多克隆抗體(美國CST公司)，抗Fibronectin兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，抗CollagenⅠ兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，miR-107抑制劑(inhibitor)、miR-107模擬物(mimic)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)，miR-107引物、第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒[(生工生物(上海)工程股份有限公司)]，小鼠重組蛋白TGF-β[(愛必信(上海)生物科技有限公司)]，自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國SUNRISE公司)，qRT-PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染采用完全培養(yǎng)基在含有體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)NIH-3T3細(xì)胞。采用2 μg/L小鼠重組蛋白TGF-β刺激NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，分為TGF-β組、對(duì)照組；下調(diào)miR-107：分為對(duì)照組(只加轉(zhuǎn)染試劑)、TGF-β組(轉(zhuǎn)染試劑+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))、TGF-β+inhibitor-NC組(轉(zhuǎn)染試劑+100 nmol/L miR-107 inhibitor-NC+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))、TGF-β+inhibitor組(轉(zhuǎn)染試劑+100 nmol/L miR-107 inhibitor+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))；上調(diào)miR-107：分為對(duì)照組(只加轉(zhuǎn)染試劑)、TGF-β組(轉(zhuǎn)染試劑+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))、TGF-β+mimic-NC組(轉(zhuǎn)染試劑+50 nmol/L miR-107 mimic-NC+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))、TGF-β+mimic組(轉(zhuǎn)染試劑+50 nmol/L miR-107 mimic+2 μg/L TGF-β誘導(dǎo))。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3 各組NIH-3T3細(xì)胞中miR-107表達(dá)的qRT-PCR檢測采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并用Nanodrop 2000檢測總RNA純度和濃度；采用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；采用qRT-PCR法檢測miR-107 mRNA的表達(dá)。q-PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s;95 ℃，3 s；60 ℃，30 s;循環(huán)數(shù)為40。溶解曲線為儀器默認(rèn)程序。miR-107上游引物序列：5’-GAGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3’，下游引物為miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒中的通用下游引物。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算miR-107表達(dá)水平[7-8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 各組NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物表達(dá)的Western blot檢測收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：濃縮膠恒壓80 V，當(dāng)?shù)鞍讐撼梢粭l線時(shí)，電壓調(diào)為120 V，繼續(xù)電泳80 min；轉(zhuǎn)PVDF膜，電流為200 mA，100 min。用50 g/L脫脂奶粉液封閉PVDF膜2 h，分別用α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin一抗(均按1∶1 000稀釋)和二抗(按1∶5 000稀釋)孵育，最后進(jìn)行ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析[9-10]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較TGF-β刺激后NIH-3T3細(xì)胞中miR-107及轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析和LDS-t檢驗(yàn)分析miR-107 inhibitor/mimic對(duì)各組NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β刺激的NIH-3T3細(xì)胞中miR-107及轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較根據(jù)課題組前期做過的TGF-β質(zhì)量濃度梯度結(jié)果顯示(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，2 μg/L TGF-β刺激時(shí)miR-107水平升高。本研究首先觀察了TGF-β刺激對(duì)NIH-3T3細(xì)胞中miR-107表達(dá)水平的影響和NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平(表1)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，TGF-β組轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

表1 TGF-β刺激的NIH-3T3細(xì)胞中miR-107及轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.2 下調(diào)miR-107后各組NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較將miR-107 inhibitor轉(zhuǎn)染至NIH-3T3細(xì)胞中，48 h后檢測細(xì)胞中miR-107的水平，TGF-β+inhibitor組(0.290±0.016)NIH-3T3細(xì)胞中miR-107表達(dá)水平較TGF-β+inhibitor-NC組(1.00±0.035)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.430，P<0.001)。Western blot檢測結(jié)果顯示(表2)，與TGF-β+NC組相比，TGF-β+inhibitor組的轉(zhuǎn)分化標(biāo)志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白水平均降低(P<0.05)。

表2 下調(diào)miR-107后NIH-3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.3 上調(diào)miR-107后各組NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較將miR-107 mimic轉(zhuǎn)染至NIH-3T3細(xì)胞中，48 h后檢測細(xì)胞中miR-107的水平，TGF-β+mimic組(2.340±0.297)NIH-3T3細(xì)胞中miR-107表達(dá)水平較TGF-β+mimic-NC組(1.000±0.139)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.070，P=0.015)。Western blot檢測結(jié)果顯示(表3)，與TGF-β+NC組相比，TGF-β+mimic組的轉(zhuǎn)分化標(biāo)志α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 上調(diào)miR-107后NIH-3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

IPF的高危影響因素包括吸煙、粉塵、胃食管反流等；同時(shí)，遺傳因素、信號(hào)傳導(dǎo)通路以及細(xì)胞因子在IPF的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用[11]。TGF-β在炎癥反應(yīng)、損傷的修復(fù)以及肺纖維化過程中具有重要作用。目前大多已知的miRNA可通過靶向調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程。但miR-107在纖維化疾病中的作用尚不明確。鑒于miRNA與纖維化的密切關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)探討miR-107在IPF中的作用。

本研究首先利用2 μg/L的TGF-β誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，收集培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β刺激的NIH-3T3細(xì)胞中miR-107的相對(duì)表達(dá)水平明顯升高。且Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，TGF-β組轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯升高，說明2 μg/L的TGF-β誘導(dǎo)48 h可以成功誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。以往有研究[12]顯示，miR-107靶向PCDH17表達(dá)調(diào)控EMT通路，從而調(diào)控胃癌細(xì)胞遷移及侵襲。在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中miR-107過表達(dá)，并通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)HT29細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成[13]。目前，miR-107在IPF中的作用機(jī)制尚不明確，但本研究以及上述研究均表明miR-107在IPF、胃癌以及結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)。

近年來，大量的研究[10，14-16]表明miRNA在纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用：miR-29b-3p在多種纖維化模型和人類纖維化疾病中呈現(xiàn)低表達(dá)；miR-133a使TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化標(biāo)志物α-SMA、CTGF和膠原蛋白表達(dá)下調(diào)。有研究[17]顯示，miR-15a的治療性修復(fù)可抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞中的纖維生成，并消除博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。本研究為了進(jìn)一步探討miR-107在IPF中的作用，采用miR-107 inhibitor和miR-107 mimic分別轉(zhuǎn)染TGF-β刺激的NIH-3T3細(xì)胞，檢測miR-107的表達(dá)水平，觀察其對(duì)IPF進(jìn)程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-107后，NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的相關(guān)標(biāo)志蛋白α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin表達(dá)水平降低；而上調(diào)miR-107使NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的相關(guān)標(biāo)志蛋白α-SMA、Collagen Ⅰ、Fibronectin表達(dá)水平升高。說明miR-107在TGF-β誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，miR-107對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞IPF進(jìn)程具有一定的作用，抑制miR-107的表達(dá)可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程。成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化在IPF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，研究成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程將有助于對(duì)纖維化疾病的了解，為IPF的研究和治療提供新的思路。