汪 輝，邵紅霞，秦秋明

（上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200438）

隨著醫(yī)藥行業(yè)的迅猛發(fā)展，公眾對(duì)藥品安全的要求也越來越高，這種要求不僅僅限于藥品本身的質(zhì)量，也逐漸擴(kuò)展到藥品的輔料及其包裝材料的質(zhì)量。人們討論藥品包裝材料的質(zhì)量時(shí)，往往想到的是包裝材料本身的質(zhì)量，藥品生產(chǎn)工藝中直接接觸的工藝組件卻容易被忽視，工藝組件與工藝液體的相容性問題也成為目前藥品研發(fā)過程中需要解決的問題。與成品包裝材料一樣，工藝組件也會(huì)有浸出物浸出的風(fēng)險(xiǎn)，一些浸出物會(huì)在生產(chǎn)過程中造成雜質(zhì)和不溶性微粒增多，影響產(chǎn)品質(zhì)量；一些浸出物會(huì)隨著生產(chǎn)過程進(jìn)入成品，最終被患者攝入而產(chǎn)生安全隱患。

業(yè)界為鼓勵(lì)企業(yè)開展科學(xué)有效的可提取物和浸出物研究，自2010 年起，生物工藝系統(tǒng)聯(lián)盟（BPSA）[1-2]和生物醫(yī)藥聯(lián)盟（BPOG）發(fā)布了一系列白皮書[3]；國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）分別在2018 年和2019 年發(fā)布了《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》[4]和《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求（征求意見稿）》[5]；美國藥典也發(fā)布USP<665>和<1665>兩個(gè)指導(dǎo)原則的征求意見稿，分別關(guān)于藥品生產(chǎn)過程中用到的聚合物部件或系統(tǒng)，旨在指導(dǎo)企業(yè)對(duì)生產(chǎn)工藝中使用到的工藝組件進(jìn)行有效的風(fēng)險(xiǎn)控制。

伏立康唑是一種三唑類抗真菌藥物，為氟康唑衍生物，具有抗菌譜廣、毒性低及抗菌效力強(qiáng)的特點(diǎn)[6-7]。國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)A 廠生產(chǎn)注射用伏立康唑的過程中要接觸不銹鋼、陶瓷泵、硅膠管道、墊片等工藝組件。硅膠管道、墊片通常以高分子材料為主體，配合其他添加劑經(jīng)過一系列工藝制成。在與工藝組件和工藝液體的接觸過程中，這些添加劑往往容易形成單體或者降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物均有可能浸出到工藝液體中，影響工藝液體的質(zhì)量，或者最終進(jìn)入藥品對(duì)患者直接產(chǎn)生安全隱患。經(jīng)對(duì)國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)A 廠的一批工藝組件（硅膠管道和墊片）進(jìn)行提取研究后，在4 種提取溶劑（酸性水相溶液、堿性水相溶液、藥液模擬液和乙醇水溶液）中，均發(fā)現(xiàn)2,5-二甲基-2,5-己二醇、4-甲基-3-戊烯酸、六甲基環(huán)三硅氧烷類似物等半揮發(fā)性有機(jī)物，檢出結(jié)果超過分析評(píng)價(jià)閾值（AET,analytical evaluation threshold）[8]。因2,5-二甲基-2,5-己二醇在所有超出AET 的化合物中安全邊界（MOS,margin of safety）值最小，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)最大，故選取其作為目標(biāo)物進(jìn)行浸出物方法學(xué)研究。

2,5-二甲基-2,5-己二醇（2,5-Dimethyl-2,5-hexanediol,DHD）極性強(qiáng)，沒有紫外吸收基團(tuán)，不適合液相分析。目前，關(guān)于DHD 檢測的相關(guān)研究未見報(bào)道。本文通過探索研究，采用超高液相色譜-電噴霧電離源-三重四極桿質(zhì)譜法（UPLCESI-MS/MS），優(yōu)化前處理方法及定量方法后，建立了測定注射用伏立康唑產(chǎn)品工藝組件中DHD浸出量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY I CLASS&QTRAP 6500 超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，含有超高效液相色譜儀（Waters 公司）、大氣壓化學(xué)電離源和三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器（AB SCIEX 公司）；XW-80A旋渦混合器（常州阿米勒儀器科技有限公司）；XPR206DR/A 型十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO 公司）；Direct 8 超純水儀（密理博公司）。

1.2 試劑和試藥

2,5-二甲基-2,5-己二醇對(duì)照品（批號(hào)T3924），購自Adamas-beta，含量為99.00%；2-甲基-2,4-戊二醇對(duì)照品（批號(hào)L0130005），購自CNW，含量為99.9%；甲醇和乙腈，購自SIGMAALDRICH，均為色譜純；氨水，購自CNW，質(zhì)譜純；甲酸銨，購自羅恩試劑，色譜純；氯化鈉，購自GENERAL-REAGENT，分析純；水為Direct 8 超純水儀制備的超純水。注射用伏立康唑樣品（批號(hào)為2006051、2006052、2006053），來自于國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)A。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH PHENYL（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A），氨水-純化水（0.1：100）(B)。梯度洗脫程序見表1，流速：0.3 mL/min，柱溫：35 ℃，樣品室溫度：15 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI（電噴霧電離源）；離子模式：負(fù)離子模式；氣簾氣（CUR）：276 kPa；碰撞氣（CAD）：Medium；離子噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣（GS1）：345 kPa；輔助加熱氣（GS2）：345 kPa。掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測離子參數(shù)見表2。

表2 2,5-二甲基-2,5-己二醇（DHD）和2-甲基戊烷-2,4-二醇（MPD）的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometric parameters for 2,5-dimethyl-2,5-hexanediol (DHD) and 2-methylpentane-2,4-diol (MPD)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

稱取DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)31.710 mg 置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解后稀釋至刻度，搖勻；量取該溶液32.0 μL 置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為10.0 μg·mL-1的DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液A。

稱取MPD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)40.105 mg 置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解后稀釋至刻度，搖勻；量取上述溶液25.0 μL 置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為10.0 μg·mL-1的MPD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液B。

量取DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液A 和MPD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液B 各170 μL，置于10 mL 量瓶中，即得對(duì)照品溶液（DHD：34.0 μg·L-1，MPD：34.0 μg·L-1）。

2.2.2 樣品溶液

樣品母液：取注射用伏立康唑樣品1 瓶，加入純化水19.00 mL 復(fù)溶。

樣品溶液：量取樣品母液5.000mL 置于20mL 樣品瓶中，加入內(nèi)標(biāo)MPD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液B 170.0 μL和萃取劑乙腈2.500 mL，再加入氯化鈉搖動(dòng)，直至瓶底出現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置10 min，量取上層清液1.000 mL 置于10 mL 量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻。平行制備2 份溶液，依次得到樣品溶液1 和樣品溶液2。

2.3 線性關(guān)系考察

分別量取純化水5.000 mL 置于若干20 mL樣品瓶中，依次加入DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液A 50 μL、100 μL、170 μL、255 μL、340 μL 以及內(nèi)標(biāo)MPD標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液B 170 μL，各加入萃取劑乙腈2.500 mL，再加入氯化鈉搖動(dòng)，直至瓶底出現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置10 min，量取上層清液1.000 mL 置于10 mL 量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，具體質(zhì)量濃度分別為：DHD：10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、34.0 μg·L-1、51.0 μg·L-1、68.0 μg·L-1；MPD：34.0 μg·L-1。分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液10 μL，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定，以DHD與內(nèi)標(biāo)物MPD 的峰面積比值Y 為縱坐標(biāo)，以DHD 與內(nèi)標(biāo)物MPD 標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度比值X為橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=0.0626X+0.0749，r=0.9990，表明DHD 在10.0～68.0 μg·L-1的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見圖1）。

圖1 DHD/MPD 線性關(guān)系圖譜Fig.1 Linear graph for DHD/MPD

2.4 定量限和檢測限測定

將對(duì)照品溶液按照2.3 項(xiàng)下的方法逐級(jí)稀釋制備，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定，以信噪比（S/N）確定DHD 的檢測下限為3.0 μg·L-1（S/N≈3），定量下限為10.0 μg·L-1（S/N≈10）。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

量取樣品母液5.000 mL 置于20 mL 樣品瓶中，分別加入DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液A 170.0 μL 以及MPD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液B 170.0 μL，加入萃取劑乙腈2.500 mL，再加入氯化鈉搖動(dòng)，直至瓶底出現(xiàn)流沙狀，渦旋0.5 min，靜置10 min，量取上層清液1.000 mL 置于10 mL 量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻。平行制備6 份，按內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算6份重復(fù)性溶液DHD 的平均含量，RSD 為1%，表明本方法的重復(fù)性良好。重復(fù)性溶液定量離子譜圖見圖2。

圖2 DHD/MPD 重復(fù)性圖譜Fig.2 Repeatability graph for DHD/MPD

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.5 中的1 份重復(fù)性溶液，分別在室溫下放置0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 時(shí)，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定，按內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：各穩(wěn)定性考察點(diǎn)結(jié)果與0 點(diǎn)的峰面積RSD 小于8%，供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

按照2.4 項(xiàng)下的方法，分別加入DHD 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液A 50.0 μL、170 μL 及255 μL，各加入內(nèi)標(biāo)MPD 170.0 μL，平行制備3 份低濃度水平、3 份中濃度水平、3 份高濃度水平供試品溶液。按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件測定，按內(nèi)標(biāo)法定量。回收率結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of recovery tests (n=9)

2.8 樣品檢測

取國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)A 廠的三批注射用伏立康唑樣品（批號(hào)為2006051、2006052、2006053），每批取1 瓶，按2.2.2 項(xiàng)方法制備樣品溶液，取10 μL 注入超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀，記錄質(zhì)譜峰峰面積，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算DHD 濃度，結(jié)合工藝液體信息，計(jì)算出每平方厘米工藝組件中DHD 的浸出量，計(jì)算公式見式（1），測定結(jié)果見表4。

表4 三批注射用伏立康唑產(chǎn)品工藝組件中DHD浸出量Tab.4 Extraction amount of DHD in voriconazole for injection in process components

3 討論

3.1 DHD 浸出量的安全性評(píng)估

通過查閱文獻(xiàn)及毒性數(shù)據(jù)庫的相關(guān)資料，DHD 被歸類為Cramer III 類物質(zhì)[9]。根據(jù)對(duì)Cramer III 類物質(zhì)的重新評(píng)估得到的毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern,TTC）表明，可以將非有機(jī)磷酸酯、非氨基甲酸酯或非有機(jī)鹵素化合物的閾值調(diào)整至4 μg/(kg·d)[10]，按成年人50 kg/人計(jì)算[11]，每日允許最大暴露量（permitted daily exposure,PDE）為200 μg/d。由于TTC 閾值是通過口服給藥數(shù)據(jù)而不是腸道給藥數(shù)據(jù)獲得的，因此，根據(jù)歐洲化學(xué)品局ECHA 關(guān)于化學(xué)安全性評(píng)估的指南[12]以及FDA 文件，口服至腸道外途徑的轉(zhuǎn)換因子設(shè)為10[13]，因此該DHD 的PDE 確定為20 μg/d。由藥品說明書可知，注射用伏立康唑每日最大使用量（acceptable daily intake，ADI）為120 mL（6 瓶，19 mL/瓶），根據(jù)樣品中檢出濃度，結(jié)合工藝液體信息計(jì)算出工藝組件每平方厘米可能遷移入藥品的量，將其與限值進(jìn)行比較，以評(píng)估遷移入藥品的DHD 是否會(huì)為患者帶來安全性風(fēng)險(xiǎn)。

式（2）中：PDE 為20 μg/d；ADI 為6 瓶/d；實(shí)際灌裝成品數(shù)量為2000 瓶；總接觸面積為4008 cm2。由此計(jì)算得到限值為1.6 μg/cm2。

表4 中DHD 的浸出量均低于其限值，表明注射用伏立康唑由工藝組件（硅膠管道、墊片）中DHD 遷移帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)較低。但不同工藝組件（硅膠管道、墊片）廠家的生產(chǎn)工藝不一樣，仍需注意DHD 在工藝組件中的浸出量。

3.2 儀器的選擇

因DHD 極性強(qiáng)、沒有紫外吸收基團(tuán)，不適合液相分析，故最初嘗試用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析方法開發(fā)。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氣質(zhì)聯(lián)用法在稀釋劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等多種溶劑中均檢出DHD，干擾較大，無法進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)。嘗試以超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行方法開發(fā)后，發(fā)現(xiàn)空白稀釋劑（水）及過程空白無干擾，故最終確定以超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法作為試驗(yàn)方法。

3.3 色譜柱的選擇

用BEH C18 色譜柱分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)供試品加標(biāo)溶液中目標(biāo)物DHD 附近有干擾峰，不能完全分離?？紤]到伏立康唑帶有氟苯基基團(tuán)，該雜質(zhì)干擾峰可能由伏立康唑的工藝雜質(zhì)引入，也可能具有類似苯環(huán)結(jié)構(gòu)，故將色譜柱更換為Phenyl 柱以增加該雜質(zhì)在色譜柱中的保留。結(jié)果表明，在BEH Phenyl 柱上，該雜質(zhì)干擾峰保留確實(shí)得到了加強(qiáng)，出峰時(shí)間由DHD 延至DHD 出峰后（見圖2中RT=3.42 min 的雜質(zhì)峰），與DHD 間分離度大大提高。故選用BEH Phenyl 柱為分析柱。

3.4 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中，分別考察了甲醇-0.05%氨水體系、甲醇-0.1%氨水體系、甲醇-0.1%甲酸銨水體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%氨水體系能得到良好的峰形及更高的峰響應(yīng)值。故選擇甲醇-0.1%氨水體系作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.5 外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)定量方法的選擇

嘗試多種前處理方式：采用直接用水稀釋后進(jìn)樣，外標(biāo)法測定，回收率小于50%；改用乙腈萃取后進(jìn)樣，外標(biāo)法測定回收率有所改善，但仍偏低，約在60%～70%之間。查詢該生產(chǎn)企業(yè)A 廠注射用伏立康唑的工藝液體配方，其中含有較大濃度的倍他環(huán)糊精鈉為輔料以增加藥物的溶解性［14-15］，懷疑倍他環(huán)糊精鈉基質(zhì)干擾回收率。為抵消樣品基質(zhì)的影響，選擇另一二醇類化合物2-甲基戊烷-2,4-二醇（MPD）為內(nèi)標(biāo)，DHD 回收率顯著改善。故選用內(nèi)標(biāo)法為定量方法。

3.6 質(zhì)譜參數(shù)的考察

對(duì)質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的DHD 和MPD 在電噴霧離子源（ESI）+/-和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）+/-的4 種方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描。結(jié)果表明，在ESI 負(fù)離子模式下DHD 和MPD中目標(biāo)物有更好的響應(yīng)，基峰均為［M-H］-。選定［M-H］-為母離子后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，尋找子離子碎片，確定豐度最高的子離子為定量離子（碎片圖見圖3 和圖4），最終確定響應(yīng)豐度最高的70.9 為DHD 定量離子，57.0 為MPD 的定量離子。確定定量離子之后，繼續(xù)在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下優(yōu)化最佳去簇電壓（DP）和最佳碰撞能量（CE），以達(dá)到最佳的檢測靈敏度。

圖3 DHD 二級(jí)離子圖Fig.3 Secondary Ion Mass Spectrogram of DHD

圖4 MPD 二級(jí)離子圖Fig.4 Secondary Ion Mass Spectrogram of MPD

4 結(jié)論

本文建立了用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）內(nèi)標(biāo)法測定注射用伏立康唑產(chǎn)品工藝組件中2,5-二甲基-2,5-己二醇的方法，對(duì)檢測器、色譜柱、流動(dòng)相、定量方法、離子對(duì)等進(jìn)行了研究，最終確立的方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于注射用伏立康唑中2,5-二甲基-2,5-己二醇的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，也可為其他類產(chǎn)品中DHD 的檢測提供參考。