鐘倫坤，胡文健，周興瑋，何 嫻，朱佳麗，陳 龍，田 柳，邵建華，孫永東

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，四川 瀘州 646699）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）多發(fā)于2～7 歲，是兒童聽力受損的最常見原因，主要以中耳積液、聽力下降為表現(xiàn)特征，治療不徹底或遷延不愈可引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒的言語、學(xué)習(xí)和行為問題[1]。目前對(duì)于SOM的治療尚無統(tǒng)一的藥物[2]。中醫(yī)認(rèn)為SOM的主要病因是正氣不足，內(nèi)蘊(yùn)濕熱，外受風(fēng)邪，致熱毒墮盛，循肝膽經(jīng)上沖于耳竅所致。清竅膠囊是我科獨(dú)創(chuàng)治療SOM的經(jīng)驗(yàn)協(xié)定方藥，其具有健脾益氣，去濕化濁之功效，效果顯著。已發(fā)現(xiàn)能改善機(jī)體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，可以達(dá)到標(biāo)本兼治，緩減中耳分泌液的產(chǎn)生，最終吸收消失，使閉塞的咽鼓管逐漸通暢，同時(shí)改善耳蝸微循環(huán)[3]。研究報(bào)道自身抗體的產(chǎn)生是這些疾病的另一個(gè)特征，涉及T 和B 細(xì)胞之間的相互作用以及T 細(xì)胞亞群之間的相互作用，包括CD4+T輔助細(xì)胞（例如Th1、Th2、Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）[4]。但目前關(guān)于清竅膠囊作用SOM的相關(guān)機(jī)制研究尚缺乏，因此，本研究探討清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎大鼠Th17、Treg 細(xì)胞及炎性因子的影響，為SOM的治療提供依據(jù)，同時(shí)也為清竅膠囊的機(jī)制研究及今后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，系統(tǒng)綜合地觀察清竅膠囊對(duì)SOM的干預(yù)與影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（240±10）g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（川）2019-189。所有大鼠均維持在20 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，光周期正常（光照12 h/黑暗12 h）條件飼養(yǎng)，大鼠被給予普通顆粒飼料飼養(yǎng)。研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院委員會(huì)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 藥物 清竅膠囊為醫(yī)院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：川藥制字Z20080310，配方為：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當(dāng)歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。強(qiáng)的松購自浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格：5 mg/片，國藥準(zhǔn)字H33021207。烏拉坦購自湖北恒綠源科技有限公司，規(guī)格：0.5 g/片，EINECS 編號(hào)：51-79-6。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；sigma 3K15 離心機(jī)（德國Sigma 公司產(chǎn)品）；SpectraMAX Plus384 酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）。卵清蛋白（OVA）購自Sigma（美國）；IL-4（貨號(hào)：ZC-36402）、TGF-β（貨號(hào)：ZC-37644）、IL-6（貨號(hào)：ZC-36404）、IFN-γ（貨號(hào)：ZC-36294）、IL-10（貨號(hào)：ZC-36379）、IL-17（貨號(hào)：ZC-36386）ELISA試劑盒（上海茁彩）。

1.4 方法

1.4.1 分泌性中耳炎大鼠模型構(gòu)建 大鼠飼養(yǎng)于恒溫（20 ℃～25 ℃）、恒濕（50%±5%），自然采光，自由飲水條件下。隨機(jī)選取24 只進(jìn)行分泌性中耳炎造模[5]：將1.2 mg 卵清蛋白溶于0.6 ml PBS 緩沖液配置成溶液，同時(shí)使用5.14 mg的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射，1 次/周，共2 周，此過程為全身致敏階段，2 周后，用20%烏拉坦以5 ml/kg的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，將15 μl 配置的OVA/PBS 混合液經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，24 h 后再次麻醉大鼠，觀察鼓膜狀態(tài)，注射第2 次，此為耳內(nèi)激發(fā)階段。24 h 后用耳內(nèi)鏡觀察和記錄鼓膜形態(tài)和中耳腔積液情況，正常大鼠鼓膜無充血，光滑透亮，錘骨柄和光錐標(biāo)志清晰，鼓室無積液。建模后可見大鼠鼓膜充血，光錐消失，鼓室混濁，鼓室積液征，建模基本成功。

1.4.2 試驗(yàn)分組及給藥方法 24 只分泌性中耳炎大鼠造模成功后，隨機(jī)分為模型組（SOM）、強(qiáng)的松組（PDN，0.003 g/100 ml）、清竅膠囊低劑量治療組（QQJN-L，0.36 g/100 ml）、清竅膠囊高劑量治療組（QQJN-M，0.72 g/100 ml），每組6 只，并設(shè)置對(duì)照組（剩余未造模大鼠6 只）。灌胃藥物容積均為0.2 ml/10 g 體質(zhì)量，清竅膠囊高劑量溶液配成濃度為0.72 g/100 ml，清竅膠囊低劑量溶液濃度為0.36 g/100 ml，強(qiáng)的松配成0.003 g/100 ml 溶液。模型組與對(duì)照組灌服相同容積的蒸餾水，1 次/d 給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.4.3 樣本采集 血樣采集：給藥結(jié)束后，抽取所有大鼠腹主動(dòng)脈血液，3000 r/min 低溫離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。組織樣本采集：脫頸處死大鼠，立即分離出大鼠脾臟和胸腺，剪少量脾臟和胸腺組織，加入適量淋巴細(xì)胞分離液，充分碾磨胸腺組織至無塊狀物，過濾，加入1640 培養(yǎng)基，15 000 r/min，20 ℃離心30 min，吸取淋巴細(xì)胞層，用于后續(xù)流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.4.4 指標(biāo)檢測(cè) ①ELISA 檢測(cè)血清因子：將離心采集的血清，按照ELISA 試劑盒說明操作檢測(cè)血清IL-4、TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-17的濃度。②流式細(xì)胞檢測(cè)脾臟和胸腺Th17/Treg 細(xì)胞：取分離好的脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞，稀釋至1×108/ml，取100 μl加入流式測(cè)定管中，分別加入5 μl FITC 標(biāo)記的CD4 McAb、5 μl APC 標(biāo)記的IL-17 McAb 或5 μl FITC 標(biāo)記的CD4 McAb、5 μl APC 標(biāo)記的CD25 McAb 后混勻，避光孵育約20 min，F(xiàn)low Cytometry Staining Buffer 1 ml 洗滌后，1400 r/min 離心5 min，棄上清液，加PBS 洗2 遍，棄上清液，加入PBS 緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)細(xì)胞/ml，于FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD4+IL-17+為Th17 含量，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞為Treg 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示使用（），比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組血清指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組TGFβ、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平升高，IL-10、IL-4 水平降低（P＜0.01）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊高劑量治療組可降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IFN-γ、IL-17 水平，升高IL-10、IL-4 水平（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清指標(biāo)比較（，pg/ml）

表1 各組血清指標(biāo)比較（，pg/ml）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.2 各組大鼠脾臟Th17、Treg 細(xì)胞含量 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟Th17、Treg 細(xì)胞含量升高（P＜0.05）；經(jīng)不同處理治療后，清竅膠囊低、高劑量治療組均可降低模型大鼠脾臟Th17、Treg 細(xì)胞（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠脾臟流式細(xì)胞檢測(cè)圖及結(jié)果比較

2.3 各組大鼠胸腺Th17、Treg 細(xì)胞含量 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺Th17、Treg 細(xì)胞含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，清竅膠囊高劑量治療組可降低模型大鼠胸腺Th17、Treg 細(xì)胞含量（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠胸腺流式細(xì)胞檢測(cè)圖及結(jié)果比較

3 討論

針對(duì)SOM的治療目前尚無統(tǒng)一有效的藥物，已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)中藥具有副作用小，藥物作用靶點(diǎn)多等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有研究也正在尋找療效確切并且對(duì)全身及局部均有效的中成藥來治療[6]。中醫(yī)認(rèn)為SOM 為“耳脹”“耳閉”，主要發(fā)病原因?yàn)轱L(fēng)邪外襲、痞塞耳竅、上壅耳竅、濕濁困耳等，辨證論治并采取相應(yīng)的治療方法，可改善SOM 臨床癥狀。清竅膠囊主要由玄參、丹參、當(dāng)歸、川牛膝、生地黃等藥物組成，方中玄參具有清熱涼血，滋陰降火之功效，現(xiàn)代研究表明其能擴(kuò)張外周血管[7]。本課題組前期研究證實(shí)清竅膠囊可通過降低SOM 動(dòng)物模型血清粘附分子表達(dá)水平來減輕大鼠聽泡粘膜炎癥反應(yīng)，抑制大鼠聽泡粘膜細(xì)胞增生，從而治療分泌性中耳炎[8]。此外，劉桂榮等[9]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明清竅膠囊可降低SOM 大鼠外周血清中IL-4的表達(dá)水平，干預(yù)Th2/Th1的比值進(jìn)而治療SOM。由此看出，清竅膠囊是通過多個(gè)靶點(diǎn)起作用，但由于更進(jìn)一步機(jī)制研究尚缺乏，故本研究探討清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎大鼠Th17、Treg 細(xì)胞及炎性因子的影響，旨在為SOM的治療提供依據(jù)。

目前，SOM的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，然而研究顯示免疫因素在SOM 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制有待深入研究[10]。在自身抗原的刺激下，Treg 細(xì)胞和其他T 細(xì)胞亞群可以在胸腺中發(fā)育。胸腺Treg 細(xì)胞在維持免疫耐受中的關(guān)鍵作用已通過觀察3 日齡新生小鼠胸腺切除誘導(dǎo)T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫得到證實(shí)[11]。Treg 抑制功能的維持需要轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，其功能本身受多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。Treg 細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10）及通過CD39 胞核水解ATP 抑制免疫反應(yīng)，而Foxp3 可在TGF-β 存在的情況下在體外誘導(dǎo)Treg[12]。輔助性T 細(xì)胞（Th17）由視黃醇相關(guān)孤兒受體γt（RORγT）誘導(dǎo)，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[13]。全基因組關(guān)聯(lián)研究強(qiáng)調(diào)了Th17 細(xì)胞在免疫性疾病中的中心作用，這些研究將Th17 細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的基因與多種疾病聯(lián)系起來，包括牛皮癬、炎癥性腸病和強(qiáng)直性脊柱炎[14，15]。本實(shí)驗(yàn)研究清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎Th17、Treg 細(xì)胞及炎性因子的調(diào)節(jié)作用結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠TGF-β、IL-6、IL-17、IFN-γ、Th17 細(xì)胞、Treg細(xì)胞水平明顯升高，IL-10、IL-4 水平明顯降低，而清竅膠囊高劑量可明顯降低模型大鼠TGF-β、IL-6、IL-17、IFN-γ、Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞水平，明顯升高IL-10、IL-4 含量，表明清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)Treg 和Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的中耳炎。

綜上所述，清竅膠囊可有效地調(diào)節(jié)Treg 和Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的中耳炎的發(fā)生及發(fā)展，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)Treg/Th17 細(xì)胞失衡狀態(tài)，改善分泌性中耳炎。