劉靜慧，李沖，徐美利，牛志平，侯玉春，劉亞娟，陳寶江*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3. 晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 056000；4. 廊坊市永清縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 廊坊 065600；5. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北 保定 071000；6. 河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

隨著我國飼料全面禁抗，抗生素替代品的需求進(jìn)一步增加，其中植物提取物是抗生素替代品研究開發(fā)中的熱點(diǎn)。綠原酸(chlorogenic acid,CGA)是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，是植物有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生一種苯丙素類化合物，其廣泛存在于多種植物中，以金銀花、杜仲中含量較高。綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝利膽、抗腫瘤等多種生物活性[1]，在動(dòng)物生產(chǎn)中有一定的應(yīng)用。伏桂華等[2]在黃河鯉魚飼糧中添加0.045%綠原酸，日增重顯著提高，肌肉中粗蛋白含量提高、粗脂肪含量降低，肌肉品質(zhì)有所改善。王宇等[3]在仔豬日糧中添加1 000 mg/kg綠原酸，料重比顯著降低，仔豬血清IgG含量顯著提高，免疫功能增強(qiáng)，小腸黏膜結(jié)構(gòu)形態(tài)得到改善。但綠原酸在兔生產(chǎn)中的研究報(bào)道較少，限制了其在兔生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此本試驗(yàn)通過飼喂含不同水平綠原酸的飼糧，研究其對伊拉肉兔生長性能、血清抗氧化性能以及肝臟抗氧化性能和肝臟微觀結(jié)構(gòu)及的影響，為其在兔生產(chǎn)中的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

選擇35日齡斷奶伊拉兔60只(由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧教學(xué)基地提供，生長試驗(yàn)全程在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧教學(xué)基地完成)，體重相近，公母各半，采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分為5組，每組12只。其中：對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加18.80 mg/kg桿菌肽鋅和15.51 mg/kg喹烯酮；綠原酸組按添加劑量分成3組，即：CGA500組、CGA1000組和CGA2000組，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加500、1 000和2 000 mg/kg綠原酸。

1.2 飼糧設(shè)計(jì)

綠原酸(有效含量≥80%)由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供。基礎(chǔ)飼糧參照谷子林[4]推薦的兔營養(yǎng)需要進(jìn)行配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

2)消化能為計(jì)算值，其他營養(yǎng)水平為實(shí)測值

1.3 飼養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)前對兔舍和籠具進(jìn)行清理和消毒，采用育成兔三層階梯式金屬籠單獨(dú)飼養(yǎng)，對每只兔籠進(jìn)行單獨(dú)編號，自然通風(fēng)和光照，試驗(yàn)期間平均溫度23 ℃，平均濕度55%，自由采食和飲水，每天8：00和18：00飼喂2次，投料后2 h對兔舍進(jìn)行糞便清理、衛(wèi)生清掃。預(yù)試期7 d，正試期28 d。預(yù)試期后空腹稱重，記錄初始體重，確定各組重量無顯著性差異后進(jìn)入正試期。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 生長性能

正式試驗(yàn)開始和第28天，分別稱量各組試驗(yàn)兔的體重獲得初始重和末重，計(jì)算平均日增重(ADG)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間試驗(yàn)兔的采食量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間試驗(yàn)兔的腹瀉情況，計(jì)算獲得腹瀉頻率，公式：腹瀉頻率=試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉只日數(shù)/(試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)只數(shù))×100%。

1.4.2 肝臟指數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后，每組挑選體重接近該組平均值試驗(yàn)兔6只，屠宰前稱量宰前活重，屠宰后取肝臟，用眼科剪剔除脂肪和結(jié)締組織后稱量器官重，計(jì)算肝臟指數(shù)，公式：肝臟指數(shù)(g/kg)=肝臟重量(g)/宰前活重(kg)。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)

試期結(jié)束后，試驗(yàn)兔空腹12 h，每只采血3 mL，采血管呈45°斜面靜置，待血清析出后4 000 r/min離心10 min，分裝上清，于-80 ℃保存待測。采用生化法測定超氧化物歧化酶( SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)的活性和水平，試劑盒購自北京百智生物科技有限公司，貨號分別為BCEA002、BCBU-011、BCOS-009，具體操作按試劑盒說明書指示進(jìn)行。

1.4.4 肝臟抗氧化性能

取試驗(yàn)兔肝臟，研磨后按1∶9比例與PBS緩沖液混勻，4 000 r/min離心10 min，分裝上清，于-80 ℃保存待測，采用生化法測定 SOD、T-AOC和MDA的活性和水平，具體操作按試劑盒說明書指示進(jìn)行。

1.4.5 肝臟微觀結(jié)構(gòu)

取各組試驗(yàn)兔肝臟左葉相同位置固定于10%福爾馬林，HE染色制作石蠟切片，在光鏡下觀察各試驗(yàn)兔肝臟微觀結(jié)構(gòu)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響

由表2可知，對照組和抗生素組間各指標(biāo)差異不顯著。與對照組及抗生素組相比，CGA2000組肉兔的末重分別顯著提高了9.90%和9.82%(P<0.05)。與對照組相比，CGA2000組肉兔的平均日增重也顯著提高了18.73%(P<0.05)。腹瀉率方面，以對照組最高，綠原酸組隨著添加劑量的增加有降低的趨勢，抗生素組最低。

表2 綠原酸對肉兔生長性能的影響

2.2 綠原酸對肉兔肝臟指數(shù)的影響

由表3可知，各組的肝臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但CGA2000組與對照組相比有上升趨勢(0.05

表3 綠原酸對肉兔肝臟指數(shù)的影響 g/kg

2.3 綠原酸對肉兔血清抗氧化性能的影響

由表4可知，與對照組相比，抗生素組T-AOC的活性提高了20.00%，差異顯著(P<0.05)，綠原酸組血清T-AOC、SOD活性及MDA水平均無顯著差異(P>0.05)，但CGA2000組T-AOC和SOD活性較對照組均有上升的趨勢(0.05

表4 綠原酸對肉兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化性能的影響

由表5可知，對照組和抗生素組各指標(biāo)差異不顯著，CGA1000組T-AOC活性較抗生素組顯著提高了20.00%(P<0.05)，其他各組內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。添加1 000～2 000 mg/kg綠原酸與對照組相比SOD和T-AOC活性均有增高趨勢，MDA水平有下降趨勢(0.05

表5 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 綠原酸對肉兔肝臟微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，對照組肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，但有少許局部輕微纖維增生與輕微點(diǎn)狀壞死，綠原酸組與抗生素組肝臟組織被膜完整，肝小葉分葉不明顯，中央靜脈內(nèi)皮完整，肝索排列較規(guī)則；肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，未見明顯病理變化。

A.對照組；B.抗生素組；C.CGA500組；D.CGA1000組；E.CGA2000組

3 討論

3.1 綠原酸對肉兔生長性能的影響

飼糧中添加CGA可以改善動(dòng)物的生長性能。劉則學(xué)等[5]報(bào)道，在仔豬飼糧中添加250 g/t 的CGA，可以使仔豬的料重比顯著降低，腹瀉頻率有降低的趨勢，改善了仔豬的生長性能。Chen等[6]在斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg的CGA后發(fā)現(xiàn)，仔豬的飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高。陳鵬等[7]在斷奶仔豬飼糧中添加CGA后發(fā)現(xiàn)，仔豬的平均日增重顯著提高，生長性能得到改善。本試驗(yàn)中，與對照組和抗生素組相比，GCA2000組肉兔的末重顯著升高，與上述報(bào)道的結(jié)果相近。分析可能的原因是通過添加CGA改善了機(jī)體抗氧化能力，從而提高了肉兔的生長性能；同時(shí)CGA還具有抗菌、消炎以及增強(qiáng)免疫力等作用，對肉兔具有益生作用[8]。

3.2 綠原酸對肉兔肝臟指數(shù)的影響

本試驗(yàn)表明添加綠原酸有改善肝臟指數(shù)的趨勢。袁俊[9]給高血糖小鼠灌服2 500 μg/g CGA后發(fā)現(xiàn)，臟器損傷好轉(zhuǎn)，肝臟腫大恢復(fù)正常，表明CGA對小鼠的肝臟有一定的保護(hù)作用。其可能的原因是CGA具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，減少了各種應(yīng)激及細(xì)菌、病毒對肉兔免疫系統(tǒng)的影響，間接有益于肝臟的發(fā)育[10]。

3.3 綠原酸對肉兔血清抗氧化性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，CGA2000組肉兔血清T-AOC和SOD活性雖無顯著差異但均有升高的趨勢，說明CGA一定程度上增強(qiáng)了肉兔的抗氧化性能。劉英等[11]報(bào)道，添加300 mg/kg CGA可以使斷奶仔豬血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)的活性顯著升高，增加了仔豬的抗氧化性能。符運(yùn)斌[12]在肉牛飼料中添加CGA后發(fā)現(xiàn)，肉牛血清中GSH-Px、SOD和 T-AOC的活性均顯著升高，MDA含量降低，減少了熱應(yīng)激下肉牛的脂質(zhì)過氧化損失。黃少文等[13]在母豬飼糧中添加300 mg/kg CGA后發(fā)現(xiàn)，母豬血清中GSH-Px和CAT分別提高了24.00%和38.56%。上述報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果相近，但CGA對肉兔抗氧化性能的改善效果不如仔豬、母豬以及肉牛，這可能和畜種及試驗(yàn)處理的差異有關(guān)。CGA是一種酚型抗氧化劑，一方面其酚羥基結(jié)構(gòu)能與自由基反應(yīng)，使其失活，減少對機(jī)體的氧化應(yīng)激；另一方面，其可以通過Keep1-Nrf2-ARE信號通路，上調(diào)其下游SOD1、CAT、GPX1、GST、GR等基因的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化酶的合成，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[14]。

3.4 綠原酸對肉兔肝臟抗氧化性能的影響

肝臟是機(jī)體代謝的重要器官，本試驗(yàn)中，添加1 000～2 000 mg/kg CGA與對照組相比，肝臟抗氧化性有提高趨勢，添加1 000 mg/kg CGA比抗生素組顯著提高了T-AOC水平，對機(jī)體肝臟抗氧化能力有所改善。栗靈皓等[15]給高糖高脂大鼠飼喂綠原酸，高劑量組可顯著提高肝臟SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活力，降低MDA水平，有效預(yù)防和減輕肝臟氧化損傷。Koriem等[16]研究證實(shí)CGA同分異構(gòu)體5-二咖啡酰奎寧酸(5-CQA)能減輕脫氧麻黃堿導(dǎo)致的大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高肝臟中SOD和GSH-Px水平，降低MDA含量。上述報(bào)道與本試驗(yàn)的結(jié)果相近，原因可能是綠原酸可通過降低血脂和肝臟脂質(zhì)的積累，提高血清和肝臟清除自由基能力和抗氧化水平[17]；也可能是綠原酸通過增加肝臟脂肪酸的作用，降低膽固醇，抑制炎癥反應(yīng)，從而增加機(jī)體抗氧化能力[18-19]。

3.5 綠原酸對肉兔肝臟微觀結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)中，對照組肉兔肝臟有少許局部輕微纖維增生與輕微點(diǎn)狀壞死，而CGA組肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，未見明顯病理變化，說明CGA對肉兔的肝臟有一定的保護(hù)作用。Feng等[20]報(bào)道CGA可以通過增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)，來緩解D-半乳糖引起的小鼠肝損傷。周艷等[10]報(bào)道添加CGA可以緩解大鼠由慢性內(nèi)毒素引起的肝損傷。史秀玲等[21]報(bào)道添加3.5～14 mg/kg的CGA可以緩解由CCl4引起的小鼠肝損傷。楊宏昕等[22]也發(fā)現(xiàn)，添加100 mg/kg的CGA可以抑制由CCl4引起小鼠肝損傷。上述報(bào)道與本試驗(yàn)的結(jié)果相近，其可能的原因是CGA可增強(qiáng)機(jī)體清除活性氧的能力和抗氧化能力，減少肝臟線粒體中的自由基，緩解肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮保肝作用[23]，此外CGA還能調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞葡萄糖的耐受性和胰島素敏感性從而改善肝臟的糖異生和脂質(zhì)代謝[24]，以及能通過抑制透明質(zhì)酸的活性增強(qiáng)肝臟的抗炎和抗感染能力[25]，減少肝臟的損傷。

綜上，添加綠原酸可以通過改善肉兔血清和肝臟的抗氧化能力來發(fā)揮保肝作用，改善肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肝臟發(fā)育，從而提高肉兔生長性能，建議添加劑量為2 000 mg/kg。