汪一平，游一，李天宇，路海君，李海利，許保疆

(1. 河南省洛陽市嵩縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽 471400；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的以發(fā)熱、腦脊髓炎、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-2]。PRV可感染包括豬、牛、羊在內(nèi)的40多種家畜和野生動物[3]。Ai等[4]研究表明PRV可感染人，并引起人的眼內(nèi)炎；Liu等[5]從人的腦脊液中成功分離到首株人源PRV毒株(hSD-1/2019)，為PRV向人群的跨物種傳播提供了一定依據(jù)。豬是PRV的天然宿主、貯存宿主和傳染源，PRV最早于1902年在匈牙利豬群中被發(fā)現(xiàn)，1947年傳入我國，20世紀(jì)70年代我國引進(jìn)了PRV弱毒活疫苗Bartha-K61株，經(jīng)過疫苗免疫接種、撲殺等措施有效控制了PR的流行，但自2011年我國華北地區(qū)PRV弱毒活疫苗免疫豬場發(fā)生PRV感染疫情后，PRV變異毒株開始在全國范圍內(nèi)迅速流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其防控與凈化形勢非常嚴(yán)峻[6-9]。為了解豫西地區(qū)近年來PRV的分子流行病學(xué)、致病性和遺傳變異情況，本研究通過PCR方法對2016—2020年采集于豫西地區(qū)的152份臨床病料進(jìn)行了PRV病原學(xué)檢測與分析、病毒分離與鑒定、gE基因遺傳變異分析等研究，豐富了豫西地區(qū)流行病學(xué)和流行毒株數(shù)據(jù)，為深入開展PRV流行規(guī)律、致病機(jī)制和防控研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016—2020年共收集豫西地區(qū)流產(chǎn)胎兒、病死豬組織病料(腦組織、淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟、脾臟)樣品共計(jì)152份(表1)，經(jīng)調(diào)查所有采集樣品的豬場均免疫過PRVgE基因缺失疫苗。豫西地區(qū)2019年以前PRV的免疫程序一般為仔豬70日齡首免Bartha-K61株疫苗1頭份，4周后加強(qiáng)免疫1頭份；2019年以來PRV的免疫程序一般為仔豬斷奶時首免變異毒株滅活疫苗1頭份，4周后加強(qiáng)免疫1頭份。

表1 豫西地區(qū)臨床樣品來源 份

1.2 菌株、細(xì)胞與試驗(yàn)動物

大腸桿菌DH5α、BHK-21細(xì)胞系，均由河南省嵩縣動物疫病控制中心實(shí)驗(yàn)室保存；36只健康清潔級新西蘭白兔，體重(2.54±0.14)kg，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 主要試劑與試劑盒

pMD18-T載體、LATaq聚合酶、2×GC Buffer、dNTP Mixture、EcoRⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶、DL2000 Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；病毒基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自北京百泰克生物科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)1對針對PRV疫苗中g(shù)E基因缺失的鑒別檢測引物，根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)1對針對PRVgE全長擴(kuò)增引物，引物序列見表2，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表2 引物信息

1.5 臨床病料樣品的處理

將采集的臨床病料樣品溶解于5倍體積滅菌PBS中，研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后即得處理后的臨床樣品。

1.6 臨床樣品的PCR擴(kuò)增

利用病毒基因組DNA提取試劑盒依次提取152份臨床樣品的病毒基因組DNA，利用設(shè)計(jì)合成的gE基因缺失鑒別檢測引物依次對152份DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×GC Buffer 12.5 μL、LATaq聚合酶0.5 μL、dNTP Mixture 2.0 μL、引物F1/R1(終濃度為20 μmol/L)各0.5 μL、DNA 3.0 μL、H2O 6.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.7 PRV流行情況分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)、不同年份PRV陽性感染率，分析不同地區(qū)、不同年份PRV的流行情況。

1.8 病毒分離與細(xì)胞病變觀察

將PCR擴(kuò)增為陽性的臨床樣品接種單層BHK-21細(xì)胞，以含2%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)維持液、置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，待70%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，收獲病毒液。如無CPE出現(xiàn)，則觀察至120 h后收獲病毒，連續(xù)盲傳5代。

1.9 病毒含量測定

將收獲的病毒液依次做10倍倍比稀釋，每個稀釋度分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的單層BHK-21細(xì)胞，每個稀釋度接種8孔，每日觀察細(xì)胞病變，按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.10 致病性試驗(yàn)

將36只新西蘭白兔隨機(jī)分為9組，每組4只，試驗(yàn)1～8組分別經(jīng)腿部肌肉注射分離毒株0.1 mL(含103TCID50)；試驗(yàn)9組為對照組，腿部肌肉注射滅菌生理鹽水0.1 mL。各試驗(yàn)組彼此間隔離飼養(yǎng)，觀察至注射后14 d，每日記錄各試驗(yàn)組兔的發(fā)病和死亡情況。采集死亡兔的腦、肝臟、脾臟等組織病料，采用1.6的方法對病料樣品進(jìn)行PCR檢測。

1.11 gE基因序列分析

1.11.1 PCR擴(kuò)增

利用病毒基因組DNA提取試劑盒依次提取分離毒株的病毒基因組DNA，利用gE基因全長擴(kuò)增引物依次對8份DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×GC Buffer 25.0 μL、LATaq聚合酶1.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、引物F2/R2(終濃度為20 μmol/L)各1.0 μL、DNA 5.0 μL、H2O 13.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.11.2 克隆載體的構(gòu)建與鑒定

將片段大小正確的分離毒株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收純化，將回收產(chǎn)物連接至大腸桿菌pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后，送寶生物(大連)工程有限公司進(jìn)行序列測定。

1.11.3 遺傳進(jìn)化分析

利用DNAStar生物學(xué)分析軟件對分離株gE基因序列與GenBank中登錄的17株國內(nèi)外PRV毒株(詳見表3)gE基因序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，分析2016—2020年豫西地區(qū)PRV遺傳變異特征。

表3 遺傳進(jìn)化分析所用毒株的信息

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品的PCR擴(kuò)增

采用PCR方法對2016—2020年收集豫西地區(qū)的152份臨床樣品進(jìn)行PRV野毒株感染的病原學(xué)檢測，共計(jì)檢測出陽性樣品21份，部分樣品電泳圖如圖1所示。

M.DL2000 Marker；1～10.臨床樣品

2.2 不同地區(qū)PRV流行情況分析

對不同地區(qū)豬群的PRV野毒株感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表4所示，豫西地區(qū)PRV野毒株平均陽性感染率為13.82%。其中嵩縣和欒川縣的陽性感染率較高，分別為21.05%和20.0%；新安縣和洛寧縣的陽性感染率較低，分別為7.14%和7.69%。表明豫西的不同地區(qū)均存在PRV野毒株的流行，表現(xiàn)散發(fā)性流行的特點(diǎn)。

表4 不同地區(qū)的檢測結(jié)果

2.3 不同年份PRV流行情況分析

對不同年份豬群的PRV野毒株陽性感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表5所示，豫西地區(qū)PRV野毒株陽性感染率在2017年和2018年達(dá)到高峰，分別為19.05%和20.69%，2019年陽性感染率開始下降，2019年和2020年分別為12.50%和8.00%，表明這2年豫西地區(qū)PRV野毒株的流行呈現(xiàn)出下降趨勢。

表5 不同年份的檢測結(jié)果

2.4 病毒分離與細(xì)胞病變觀察

21份PRV野毒株陽性病料樣品分別接種單層BHK-21細(xì)胞后，有8份樣品在接種48 h后出現(xiàn)細(xì)胞變圓變大、聚集拉網(wǎng)、脫落等典型CPE(圖2)，而其他13份樣品接種的單層BHK-21細(xì)胞未出現(xiàn)CPE。能夠引起單層BHK-21細(xì)胞發(fā)生CPE的8個分離毒株的命名情況見表6，8株分離毒株有6株來源于發(fā)病豬的腦組織樣品，腦組織為PRV分離的首選病料。

A.正常BHK-21細(xì)胞；B.RY2017；C. SX2018；D. YY2018；E. LC2019；F. LS2019；G. YS2020；H. SX2020；I. LN2020

表6 分離毒株名稱及來源

2.5 病毒含量測定

按照Reed-Muench法計(jì)算8個分離毒株每毫升TCID50分別為10-6.50、10-6.12、10-6.61、10-6.33、10-6.50、10-6.12、10-6.77和10-5.88。

2.6 致病性試驗(yàn)

8株分離毒株攻毒新西蘭白兔后24 h開始出現(xiàn)厭食、奇癢、撕咬接種部位等典型癥狀，隨后表現(xiàn)出興奮、呼吸急促、全身陣發(fā)性痙攣，最后抽搐而死，死后身體呈現(xiàn)“角弓反張”姿勢。至攻毒后96 h，8個分離毒株攻擊的32只新西蘭白兔全部死亡，剖檢可見肺臟大面積出血、肝臟和脾臟淤血明顯、淋巴結(jié)出血；采集死亡兔的腦、淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等組織病料經(jīng)PCR檢測均為PRV野毒株陽性。對照組的4只新西蘭白兔未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，精神狀態(tài)、食欲等良好，至試驗(yàn)結(jié)束后撲殺，采集腦、肝臟、脾臟等組織進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均為PRV野毒株陰性。表明8個分離毒株對新西蘭白兔均具有較高的致病性，均為高致病性毒株。

2.7 gE基因序列分析

8個分離毒株gE基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 740 bp處均有特異性擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期一致。gE基因重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，均在1 740 bp處有特異性條帶。將8個分離毒株gE基因序列與GenBank中登錄的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果如圖5所示，8個分離毒株gE基因與GenBank中登錄PRV流行毒株gE基因核苷酸序列同源性在97.4%～100%之間，其中SX2020、LN2020、YS2020毒株與GenBank中登錄號為MT274422.1的同源性達(dá)100%。構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹如圖6所示，8個分離株與國內(nèi)2012年以來的PRV毒株屬于一個大分支，與Kaplan株、Becker株等國外分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，后者處于進(jìn)化樹的另一大分支。8個分離株與Ea株、LA株、Min-A株等經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于進(jìn)化樹的不同小分支中；與HN1201株、HB-LF/2020株等國內(nèi)流行的變異毒株親緣關(guān)系較近，處于進(jìn)化樹的同一個小分支中。分析8個分離毒株與國外經(jīng)典株Kaplan株、國內(nèi)經(jīng)典株Ea株差異氨基酸信息，發(fā)現(xiàn)8個分離株與國外經(jīng)典株Kaplan株的同源性在94.82%～96.02%之間，與國內(nèi)經(jīng)典株Ea株的氨基酸同源性在98.10%～99.14%之間，與國內(nèi)經(jīng)典株Ea株氨基酸同源性較高。8個分離株、國內(nèi)經(jīng)典株Ea株與國外分離株Kaplan株相比，均在59位、63位、106位、122位、149位、179位、181位、215位、216位、300位、471位、473位、510位分別具有N→D、D→N、V→L、A→S、R→M、T→S、Q→L、L→A、A→D、T→A、G→R、R→H、G→S的變異，均在48位存在D氨基酸的插入。8個分離株與國內(nèi)經(jīng)典株Ea株、國外經(jīng)典株Kaplan株相比，共同存在54位G→D、448位V→I的變異，496位存在D氨基酸的插入。gE基因核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化分析表明8個分離毒株均為國內(nèi)近幾年流行的變異型PRV。

M. DL2000 Marker；1～8. 分離毒株；9. 陰性對照

M. DL2000 Marker；1～8. 分離毒株

圖5 分離毒株gE基因核苷酸同源性比較

注：▲為本試驗(yàn)分離株

3 討論

自2011年以來，PRV變異毒株的流行導(dǎo)致已經(jīng)免疫PR疫苗豬群發(fā)生PRV感染，我國養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū)均存在不同程度的PRV野毒感染陽性率。黨佳佳等[12]采用PCR方法對2017—2019年廣西地區(qū)采集的284份臨床病料樣品進(jìn)行PRV病原學(xué)檢測，PRV野毒感染率為29.9%。趙碩等[13]采用PCR方法對2013—2018年廣西地區(qū)采集的714份組織樣品進(jìn)行PRV病原學(xué)檢測，PRV野毒感染率為24.5%。陳馳等[14]采用gE-ELISA抗體檢測方法對2018—2019年采集于江蘇、河南和江西3省111家規(guī)模豬場3 804份豬血清樣品進(jìn)行PRV野毒抗體檢測，檢測出陽性樣品1 398份，PRV野毒抗體陽性率為36.75%。胡玲玲等[15]采用gE-ELISA抗體檢測方法對2016—2017年采集于貴州省16個規(guī)?；i場1 430份豬血清樣品進(jìn)行PRV野毒抗體檢測，檢測出陽性樣品27份，PRV野毒抗體陽性率為1.89%。李海琴等[16]采用PCR方法對2017—2018年江西省采集的472份組織樣品進(jìn)行PRV病原學(xué)檢測，PRV野毒陽性感染率為5.93%。本研究采用PCR方法對2016—2020年收集于豫西地區(qū)的152份臨床病料樣品進(jìn)行PRV病原學(xué)檢測，共計(jì)檢測出陽性樣品21份，PRV野毒平均陽性感染率為13.82%。本研究的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果低于黨佳佳等[12]、趙碩等[13]、陳馳等[14]的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，高于胡玲玲等[15]、李海琴等[16]的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。說明不同地區(qū)PRV野毒株感染程度差異較大，這可能與不同地區(qū)的日常飼養(yǎng)管理水平和綜合防控力度有關(guān)，豫西地區(qū)當(dāng)前PRV的綜合防控工作相對于國內(nèi)其他部分地區(qū)仍具有較大的提升空間。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)2016—2020年期間的豫西地區(qū)PRV野毒株陽性感染率在2017年和2018年達(dá)到高峰，2019年陽性感染率開始下降，近2年(2019年和2020年)豫西地區(qū)PRV野毒株的流行呈現(xiàn)出大幅下降趨勢，其主要原因可能有2個：一個可能是隨著PRV變異毒株的危害逐步增加，規(guī)模化豬場免疫了針對變異毒株的滅活疫苗，國內(nèi)首個豬偽狂犬病變異毒株滅活疫苗于2019年4月獲得了中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的批簽發(fā)，經(jīng)調(diào)查2019年以來豫西地區(qū)規(guī)?；i場PRV的免疫程序一般為仔豬斷奶時首免豬偽狂犬病變異毒株滅活疫苗1頭份，4周后加強(qiáng)免疫1頭份，母豬產(chǎn)前4周加強(qiáng)免疫豬偽狂犬病變異毒株滅活疫苗1頭份，PRV變異毒株滅活疫苗在河南地區(qū)的免疫接種有效保護(hù)了PRV變異毒株的感染；另一個可能是非洲豬瘟疫情發(fā)生后，豫西地區(qū)整體上加強(qiáng)了生物安全管理措施。

PRV可在BHK-21細(xì)胞系上能夠穩(wěn)定生長繁殖，并能夠引起B(yǎng)HK-21細(xì)胞產(chǎn)生變圓變大、聚集拉網(wǎng)、脫落等典型細(xì)胞病變[11]，故本研究利用BHK-21細(xì)胞系對21份PCR檢測為PRV野毒株陽性的臨床病料樣品進(jìn)行了病毒分離培養(yǎng)，結(jié)果成功分離到了8株P(guān)RV流行毒株，病毒分離率38.10%。分析病毒分離成功率比較低的原因主要有2個：一個主要原因可能是本研究收集的臨床病料樣品為2016—2020年的保存樣品，部分樣品的保存時間較長，病料樣品在長期保存、運(yùn)輸過程中有可能導(dǎo)致PRV失活；另一個主要原因可能是PCR方法檢測臨床病料樣品具有非常高的靈敏度，PCR檢測為PRV野毒株陽性的病料樣品有可能其病毒含量較低，無法達(dá)到能夠在細(xì)胞中生長繁殖的含量要求，導(dǎo)致無法成功分離到病毒。

PRV對兔、鼠、犬等多種動物均易感，故可用小鼠、家兔等實(shí)驗(yàn)動物評價PRV的致病力和毒力。早在2001年，田晶華等[17]就曾對家兔人工感染疑似PRV感染的豬腦組織，通過觀察家兔是否具有不可忍受的奇癢、撕咬等臨床表現(xiàn)診斷PRV。崔歡等[18]、徐寧等[19]均利用家兔進(jìn)行了PRV分離毒株的致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示高致病性PRV分離毒株均能引起家兔出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢、撕咬注射部位等臨床特征，且家兔于病毒感染后3～4 d內(nèi)全部死亡。鑒于此，本研究參照崔歡等[18]、徐寧等[19]的方法，利用新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)動物模型分析了8個分離毒株的致病性，結(jié)果表明8個分離毒株攻擊的新西蘭白兔均陸續(xù)出現(xiàn)厭食、奇癢、撕咬接種部位、興奮、呼吸急促、全身陣發(fā)性痙攣等臨床癥狀，且8個分離毒株攻擊的32只新西蘭白兔在攻毒后96 h內(nèi)全部死亡，死亡兔的組織病料經(jīng)PCR檢測均為PRV野毒株陽性，表明8個分離毒株對新西蘭白兔均具有較高的致病性，均為高致病性毒株，本實(shí)驗(yàn)室下一步將選擇合適的試驗(yàn)場地進(jìn)一步分析8株分離毒株對豬的致病性。

PRV長期流行過程中，在疫苗免疫選擇的壓力下，臨床流行毒株通過突變、缺失等多種機(jī)制不斷發(fā)生變異，隨著抗原變異的不斷積累，出現(xiàn)了病毒毒力和致病力增強(qiáng)的變異毒株。PRV變異毒株的流行大大降低了傳統(tǒng)疫苗的免疫效果，嚴(yán)偉東等[20]分析了Bartha-K61株活疫苗對PRV流行毒株的保護(hù)效力，結(jié)果表明Bartha-K61株活疫苗對傳統(tǒng)流行毒株(PRV-Ea株)具有良好保護(hù)效果，而對變異毒株(PRV-XT株)不能提供完全保護(hù)。王玉宙等[21]評估了PRV變異毒株(HN1201株)滅活疫苗對PRV流行毒株的保護(hù)效力，結(jié)果表明HN1201株滅活疫苗對傳統(tǒng)流行毒株(閩A株)和變異毒株(HN1201株)均可提供完全保護(hù)。故掌握不同地區(qū)不同時間的流行毒株，對不同地區(qū)選擇合適疫苗采取針對性的PRV綜合防控至關(guān)重要。gE基因是PRV主要毒力基因和病毒復(fù)制非必需基因，也是PRV基因缺失疫苗和野毒株鑒別診斷的標(biāo)記基因，是研究分析PRV遺傳變異情況的首選基因。鑒于此，本研究對8株分離毒株的gE基因進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果表明8株分離毒株與Kaplan株、Becker株等國外分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于進(jìn)化樹的不同大分支。而與國內(nèi)所分離毒株處于進(jìn)化樹的同一個大分支中，但與Ea株、LA株、Min-A株等傳統(tǒng)流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處于進(jìn)化樹的不同小分支中；與HN1201株、HB-LF/2020株等國內(nèi)2012年以來流行的變異毒株親緣關(guān)系較近，處于進(jìn)化樹的同一個小分支中。本研究從分子水平揭示了2016—2020年豫西地區(qū)的PRV流行特征，為豫西地區(qū)PRV的綜合防控提供了參考依據(jù)。