彭全輝 岳雙明 王之盛 薛 白 王立志 田 剛 康 坤 胡 瑞

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.四川水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，成都 611230)

酵母菌屬于兼性厭氧菌，其家族龐大，種類(lèi)超過(guò)1 000種，其中的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為飼料添加劑在反芻動(dòng)物中使用已超過(guò)70年。眾多研究表明，反芻動(dòng)物飼糧中添加釀酒酵母或酵母培養(yǎng)物可提高飼糧纖維消化率[1-4]，提高奶產(chǎn)量，改善乳品質(zhì)[5-7]，提高日增重[8]。但是，前人的報(bào)道多認(rèn)為酵母起作用主要是因?yàn)槠淠軌蛳牧鑫竷?nèi)氧氣，提高乳酸利用菌如巨型球菌屬(Megasphaera)和月形單胞菌屬(Selenomonas)和纖維分解菌如纖維桿菌屬(Fibrobacter)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等的相對(duì)豐度，降低蛋白質(zhì)降解菌如普雷沃氏菌屬(Prevotella)、互養(yǎng)球菌屬(Syntrophococcus)和光崗菌屬(Mitsuokella)等的相對(duì)豐度[9-11]，從而加速瘤胃內(nèi)乳酸分解代謝，穩(wěn)定瘤胃pH[8]，降低氧化還原電位，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，改善動(dòng)物健康，提高生產(chǎn)性能。但是，這些研究主要從細(xì)菌的角度解釋了釀酒酵母起作用的原因。厭氧真菌于1975年被發(fā)現(xiàn)是瘤胃微生物重要的組成部分[12]，因?yàn)榫哂欣w維小體和氫化酶體而被認(rèn)為是瘤胃內(nèi)最為有效的降解木質(zhì)纖維素的微生物類(lèi)群[13]，工業(yè)上用作幫助降解纖維從而更高效率地生產(chǎn)生物能源[14-15]。目前，飼糧添加活性干酵母對(duì)瘤胃真菌的影響未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加活性干酵母對(duì)肉牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和瘤胃真菌群落組成的影響，并從瘤胃真菌的角度解釋活性干酵母提高飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的原因，為釀酒酵母在反芻動(dòng)物飼糧中的應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的活性干酵母為反芻動(dòng)物專(zhuān)用釀酒酵母，活細(xì)胞數(shù)≥2×1010CFU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照我國(guó)《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)[16]，按照體重150 kg、日增重1.1 kg設(shè)計(jì)配方，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。牛只單欄飼養(yǎng)，試驗(yàn)前對(duì)場(chǎng)地進(jìn)行消毒，并對(duì)供試牛進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)。每天08:00和20:00按時(shí)飼喂，將活性干酵母與飼糧拌均勻后供牛只采食，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品收集與處理

于正試期第80天開(kāi)始，每2周取1次飼糧樣品，每次4份，每份2 kg，混勻后按照四分法收集飼糧樣品，裝入密封袋并于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。于正式試驗(yàn)結(jié)束的前4天開(kāi)始對(duì)所有18頭牛采用全收糞法連續(xù)收集新鮮糞便，用10%硫酸固氮保存。將飼糧和糞便樣品于65 ℃烘干后粉碎過(guò)1 mm篩保存，用以測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。干物質(zhì)(DM)含量參照GB/T 6435—2014測(cè)定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量參照GB/T 6432—2018測(cè)定，粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006測(cè)定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量分別參照GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007測(cè)定，鈣含量參照GB/T 6436—2002測(cè)定，磷含量參照GB/T 6437—2002測(cè)定。各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的計(jì)算公式如下：

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(食入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量-糞中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量)/食入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。

試驗(yàn)結(jié)束后全部牛只屠宰后分別在瘤胃背囊、腹囊、左縱溝和右縱溝等部位共收集瘤胃內(nèi)容物約100 g，混勻后置于-80 ℃冰箱保存，用以測(cè)定瘤胃真菌組成。

1.4 瘤胃液微生物總DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexade-cyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取瘤胃液樣品的基因組總DNA，檢測(cè)純度和濃度后，稀釋至1 ng/μL備用。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用ITS1-5F(200～400 bp)進(jìn)行瘤胃液真菌PCR擴(kuò)增，通用引物為：ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%凝膠電泳檢測(cè)，使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen公司，德國(guó))純化PCR產(chǎn)物。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Qubit和PCR進(jìn)行定量，構(gòu)建文庫(kù)合格后，使用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.5 序列分析

根據(jù)Barcode和PCR擴(kuò)增引物序列從原始數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags(raw Tags)數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量Tags(clean Tags)數(shù)據(jù)。高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)序列通過(guò)UCHIME Algorithm與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到有效Tags(effective Tags)數(shù)據(jù)。

1.6 操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類(lèi)和物種注釋

利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部有效Tags進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)成為OTUs，同時(shí)篩選出OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肣IIME 1.9.1軟件[17]中的Blast方法與Unit數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析，并分別在門(mén)(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)各個(gè)分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的多樣性分析均基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行初步處理，然后采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)進(jìn)行組間差異顯著性比較，數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加活性干酵母對(duì)肉牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表2可知，ADY2組和ADY4組的NDF和ADF表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但ADY2組和ADY4組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組之間DM、CP和EE表觀消化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧添加活性干酵母對(duì)肉牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.2 OTUs比較分析

3個(gè)組的OTUs比較韋恩圖見(jiàn)圖1。按97%一致性的原則對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，對(duì)照組僅鑒定出272個(gè)OTUs，ADY2組和ADY4組分別鑒定出了543和527個(gè)OTUs。對(duì)照組與ADY2組共有17個(gè)OTUs，對(duì)照組與ADY4組共有63個(gè)OTUs，ADY2組與ADY4組共有19個(gè)OTUs，3個(gè)組共有93個(gè)OTUs。

CON：對(duì)照組 control group；ADY2：ADY2組 ADY2 group；ADY4：ADY4組 ADY4 group。下圖同 the same as below.

2.3 α多樣性指數(shù)

由圖2可知，ADY2組和ADY4組的Simpson和Shannon指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且ADY2組極顯著高于ADY4組(P<0.01)。ADY2組和ADY4組的Chao1和PD指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，ADY2組的PD指數(shù)顯著高于ADY4組(P<0.05)，ADY2組的Chao1指數(shù)與ADY4組差異不顯著(P>0.05)。

*：差異顯著(P<0.05)；**：差異極顯著(P<0.01)；NS：差異不顯著(P>0.05)。

2.4 主坐標(biāo)分析(PCoA)

3個(gè)組基于Unweighted和Weighted Unifrac距離的PCoA見(jiàn)圖3。Weighted Unifrac距離的PCoA見(jiàn)圖3-A，對(duì)照組在縱坐標(biāo)方向與ADY2組和ADY4組區(qū)分開(kāi)來(lái)，主坐標(biāo)1(PCo1)解釋87%的變量。ADY2組和ADY4組的樣品相互交叉，不能清晰地區(qū)分開(kāi)?；赨nweighted Unifrac距離的PCoA見(jiàn)圖3-B，3個(gè)組的樣本組內(nèi)差異較小因而距離較小，對(duì)照組與ADY2組在縱坐標(biāo)上能夠明確區(qū)分開(kāi)，PCo1解釋29.4%的變量。對(duì)照組與ADY4組在橫坐標(biāo)上能夠明確區(qū)分開(kāi)，主坐標(biāo)2(PCo2)解釋16.9%的變量。

圖3 基于Unweighted和Weighted Unifrac距離的PCoA

2.5 UPGMA聚類(lèi)分析

通過(guò)Mothur軟件將18個(gè)樣本進(jìn)行UPGMA分類(lèi)樹(shù)分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4-A可知，ADY2組和ADY4組在門(mén)水平上在0.2的距離上聚為一類(lèi)，之后再與對(duì)照組在>0.6的距離上進(jìn)行聚類(lèi)。由圖4-B可知，在屬水平也與門(mén)水平相似，ADY2組和ADY4組在屬水平上在0.3的距離上聚為一類(lèi)，之后再與對(duì)照組在>0.6的距離上進(jìn)行聚類(lèi)。

Ascomycot：子囊菌門(mén)；Neocallimastigomycota：新麗鞭毛菌門(mén)；Basidiomycota：擔(dān)子菌門(mén)；Mucoromycota：毛霉門(mén)；Glomeromycota：球囊菌門(mén)；Rozellomycota：隱真菌門(mén)；Chytridiomycota：壺菌門(mén)；Others其他。Neocallimastix：新美鞭菌屬；Orpinomyces：根囊鞭菌屬；Candida：念珠菌屬；Symbiotaphrina：煙草甲體內(nèi)共生菌；Priomyces：梨囊鞭菌屬；Aspergillus：曲霉菌屬；Yarrowia：亞羅酵母屬；Macrorhabdus：鸚鵡胃癌酵母菌；Cercospora：尾孢菌屬；Rhexocercosporidium：山豆根內(nèi)生真菌。圖5同 the same as Table 5.

2.6 瘤胃真菌菌群組成差異變化分析

2.6.1 門(mén)水平

從表3和圖5-A可知，從18個(gè)瘤胃樣品中共鑒定出7個(gè)門(mén)，分別是子囊菌門(mén)(Ascomycota)、新麗鞭毛菌門(mén)(Neocallimastigomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、毛霉門(mén)(Mucoromycota)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota)、隱真菌門(mén)(Rozellomycota)和其他真菌門(mén)(Fungi_NA)。ADY2和組ADY4組的子囊菌門(mén)、新麗鞭毛菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；ADY2組和ADY4組其他真菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且ADY2組顯著低于ADY4組(P<0.05)。

表3 飼糧添加活性干酵母對(duì)肉牛瘤胃菌群門(mén)水平相對(duì)豐度差異分析

2.6.2 屬水平

本試驗(yàn)共鑒定出98個(gè)真菌屬，表4列出了相對(duì)豐度較高的26個(gè)屬。由表4和圖5-B可知，ADY2組和ADY4組未分類(lèi)真菌屬(unclassified_fungi)的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；ADY2組新麗鞭菌屬(Neocallimastix)、根囊鞭菌屬(Orpinomyces)和念珠菌屬(Candida)的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組和ADY4組(P<0.05)，ADY4組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧添加活性干酵母對(duì)肉牛瘤胃菌群屬水平相對(duì)豐度差異分析

圖5 在門(mén)和屬水平上真菌的相對(duì)豐度

3 討 論

直到1975年，Orpin[12]在綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了帶鞭毛的游動(dòng)孢子，這種孢子具有活動(dòng)階段(孢子)和非活動(dòng)階段(營(yíng)養(yǎng)體)，從而正式確認(rèn)其為嚴(yán)格厭氧的真菌。之所以這么晚才發(fā)現(xiàn)真菌可能與研究者對(duì)瘤胃液的采集方法有關(guān)。一般采用紗布過(guò)濾收集瘤胃液作為研究對(duì)象，而這樣主要獲得了游動(dòng)的孢子，而忽略了瘤胃內(nèi)容物上附著的大量真菌菌體。此后也有研究表明，瘤胃上皮棲息的菌群對(duì)于保持瘤胃健康、提高揮發(fā)性脂肪酸的吸收也起著至關(guān)重要的作用[18-19]。本試驗(yàn)則通過(guò)采集瘤胃內(nèi)容物，進(jìn)而從內(nèi)容物上通過(guò)離心分離獲得真菌菌體進(jìn)行研究。

釀酒酵母在反芻動(dòng)物中已經(jīng)成功應(yīng)用70多年。諸多報(bào)道表明，外源添加酵母能夠提高飼糧NDF和ADF表觀消化率[2,20]，但也有報(bào)道表明，外源添加酵母對(duì)飼糧的NDF和ADF等表觀消化率沒(méi)有顯著改善[23-24]。導(dǎo)致不一致結(jié)果的主要原因可能是因?yàn)椴煌囼?yàn)的飼糧結(jié)構(gòu)和動(dòng)物品種不同。盡管都是反芻動(dòng)物，奶牛和綿羊的生產(chǎn)目的不同，飼糧結(jié)構(gòu)差異較大，因而瘤胃菌群結(jié)構(gòu)組成大相庭徑[10]。此前對(duì)于外源添加活性干酵母提高飼糧纖維消化率的解釋則主要集中在瘤胃纖維降解菌方面，如提高了瘤胃產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)等的相對(duì)豐度[25]，提高了瘤胃內(nèi)纖維降解酶活性[10,26]，而外源添加活性干酵母對(duì)瘤胃真菌組成有何影響則少有涉及[25]。

OTUs數(shù)量是衡量一個(gè)生境中菌群多樣性的指標(biāo)。ADY2組和ADY4組的OUTs數(shù)量較對(duì)照組提高了約1倍，說(shuō)明飼糧添加活性干酵母促進(jìn)了瘤胃內(nèi)真菌的生長(zhǎng)。ADY2組和ADY4組的Chao1和PD指數(shù)均高于對(duì)照組，說(shuō)明飼糧添加活性干酵母提高了瘤胃內(nèi)真菌菌群的豐富度。ADY2組的PD指數(shù)高于ADY4組，說(shuō)明飼糧添加2 g/(d·頭)活性干酵母提高瘤胃真菌豐富度的效果優(yōu)于添加4 g/(d·頭)。ADY2組和ADY4組的Simpson和Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，表明飼糧添加活性干酵母改善了瘤胃內(nèi)真菌組成的均勻度。ADY2組Simpson和Shannon指數(shù)高于ADY4組，說(shuō)明飼糧添加2 g/(d·頭)活性干酵母提高瘤胃真菌均勻度的效果也優(yōu)于添加4 g/(d·頭)。飼糧添加活性干酵母影響瘤胃內(nèi)真菌菌群組成存在顯著的劑量效應(yīng)。

Weighted和Unweighted Unifrac PCoA的結(jié)果顯示，對(duì)照組、ADY2組和ADY4組之間的樣品能清晰地分開(kāi)，進(jìn)一步說(shuō)明飼糧添加活性干酵母改變了瘤胃生境中真菌群落組成，使ADY2組和ADY4組能清晰地區(qū)別于對(duì)照組。對(duì)照組的幾個(gè)樣本間的距離較遠(yuǎn)，而ADY2組和ADY4組內(nèi)的幾個(gè)點(diǎn)距離較近，進(jìn)一步說(shuō)明飼糧添加外源活性干酵母提高了瘤胃真菌菌群均勻度。此外，Weighted Unifrac PCoA的結(jié)果顯示，ADY2組和ADY4組也能清晰地區(qū)分開(kāi)，再一次說(shuō)明飼糧添加活性干酵母影響瘤胃內(nèi)真菌菌群組成存在顯著的劑量效應(yīng)。對(duì)照組、ADY2組和ADY4組之間的樣品能清晰區(qū)分開(kāi)的結(jié)果在UPGMA聚類(lèi)圖中也體現(xiàn)出來(lái)，ADY2組和ADY4組先在較近的距離上聚為一個(gè)小分支，再與對(duì)照組在較遠(yuǎn)的距離上進(jìn)行聚類(lèi)，說(shuō)明飼糧添加活性干酵母后的瘤胃真菌組成的相似性更高。

前人的研究表明，灘羊瘤胃中的相對(duì)豐度最高的是子囊菌門(mén)和新麗鞭毛菌門(mén)[13]，這與本研究中ADY2組的結(jié)果相似。但是本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組中相對(duì)豐度最高(63.6%)的是其他真菌門(mén)，而ADY2組的其他真菌門(mén)的相對(duì)豐度則顯著降低至0.041。與此同時(shí)，ADY2組子囊菌門(mén)、新麗鞭毛菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著提高。由此產(chǎn)生的結(jié)果是飼糧的NDF和ADF表觀消化率提高，說(shuō)明其他真菌門(mén)降解纖維的能力低于子囊菌門(mén)、新麗鞭毛菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)。飼糧添加2 g/(d·頭)活性干酵母顯著提高了將新麗鞭菌屬、根囊鞭菌屬和念珠菌屬的相對(duì)豐度，說(shuō)明新麗鞭菌屬、根囊鞭菌屬和念珠菌屬真菌在降解飼糧纖維成分方面起重要作用[26]。但是，飼糧添加4 g/(d·頭)活性干酵母后其新麗鞭菌屬、根囊鞭菌屬和念珠菌屬的相對(duì)豐度則與對(duì)照組無(wú)顯著差異，這再次表明外源飼糧添加活性干酵母對(duì)瘤胃內(nèi)真菌菌群組成存在劑量效應(yīng)，過(guò)高的添加劑量并不利于提高纖維消化率。在本試驗(yàn)條件下，飼糧添加2 g/(d·頭)活性干酵母對(duì)于改善瘤胃真菌組成最為有利。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加活性干酵母提高了肉牛瘤胃子囊菌門(mén)、新麗鞭毛菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度，提高了新麗鞭菌屬、根囊鞭菌屬和念珠菌屬的相對(duì)豐度，降低了未分類(lèi)真菌屬的相對(duì)豐度。

② 飼糧添加2 g/(d·頭)活性干酵母足以改變?nèi)馀Ａ鑫刚婢航M成，從而提高飼糧纖維物質(zhì)表觀消化率。