李友瑞 張子晗 熊世江 宋花蕾

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603； 2 山東大學(xué)口腔醫(yī)院 山東 濟(jì)南 250012

外傷、先天發(fā)育異常、腫瘤手術(shù)切除等可導(dǎo)致嚴(yán)重的頜面骨缺損，嚴(yán)重影響患者的發(fā)音、美觀及功能[1]。目前骨缺損的修復(fù)主要采用自體骨移植、異體骨移植以及牽張成骨等技術(shù)，但常存在繼發(fā)損傷、免疫排斥、塑形性差、成骨能力有限以及技術(shù)要求高等問題[2]。近年來，骨組織工程的研究為骨缺損的修復(fù)提供了新的方案選擇，支架材料是骨組織工程的三要素之一，是骨組織工程研究的重點。支架材料是由促進(jìn)細(xì)胞粘附的生物活性材料制備而成，應(yīng)具有多孔的三維結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和分化并有足夠的機(jī)械強(qiáng)度。羥基磷灰石是天然骨的主要無機(jī)成分，有較高的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，被廣泛用作骨組織替代和再生的生物材料[3]，然而納米羥基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)因機(jī)械性能差、易脆等特點限制其應(yīng)用。有學(xué)者嘗試將納米羥基磷灰石與生物聚合物/有機(jī)材料結(jié)合成復(fù)合形式，以克服其機(jī)械性能的劣勢。近年來常用的有機(jī)材料主要有聚-L-乳酸(PLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚-L-乙醇酸(PLGA)、聚(羥基丁酸酯-共-戊酸酯)(PHBV)、纖維素和聚乙烯醇(PVA)等高分子材料，其中PCL是一種具有良好生物相容性且可生物降解的無毒聚合物[4]，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)工程和藥物控釋等研究，然而其自身具有弱親水性、骨誘導(dǎo)活性較差等特點。靜電紡技術(shù)可將有機(jī)聚合物制備成具有三維結(jié)構(gòu)的生物支架，制作簡單，性能穩(wěn)定。本研究旨在研究聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜的理化表征及其與MC3T3-E1細(xì)胞的相互作用，探討復(fù)合纖維膜是否適合應(yīng)用于骨組織工程。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 聚己內(nèi)酯(Sigma，美國)；納米羥基磷灰石(麥克林，上海)；羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Sigma，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，美國)；實時熒光定量PCR試劑盒(Roche，美國)；CCK-8檢測試劑(日本同仁)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天，上海)；高壓電源(東文高壓電源，天津)；微量注射泵(康康醫(yī)療，安徽)；掃描電子顯微鏡(EVO LS15，Zeiss，德國)；透射電子顯微鏡(HT7700，HITACHI，日本)；接觸角檢測儀(Harke，北京)；熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(Corbett, 澳大利亞)；激光共聚焦顯微鏡(TCS SPE，Leica，德國)；萬能力學(xué)測量儀(Instron5565，美國)；MC3T3-E1細(xì)胞(武漢大學(xué)口腔重點實驗室贈送)。

1.2 實驗方法

1.2.1 靜電紡纖維膜的制備 常溫下，2.4 g PCL溶解于5 mL DMF與7.5 mL DCM的混合溶液中，標(biāo)記為純PCL組。然后按照30%、40%(wt/wt)比例加入納米羥基磷灰石，磁力攪拌至少8 h至完全混合均勻，分別標(biāo)記為PCL+30%nHA組、PCL+40%nHA組。靜電紡絲制備過程均用同一高壓電源及微量泵，保持環(huán)境在適宜的溫度和濕度。具體條件是：高壓電壓為(25±0.5)kV，靜電紡絲溶液流速3 mL/h，接收板到針尖的距離為20 cm。靜電紡絲成膜后，室溫下收集置于真空干燥箱備用。

1.2.2 SEM及TEM檢測 用導(dǎo)電膠將4.5 mm×4.5 mm大小的靜電紡絲膜固定在金屬載物臺，表面噴金后，掃描電鏡觀察復(fù)合纖維支架的形態(tài)并計算納米纖維的平均直徑。靜電紡絲纖維膜接收到有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫干燥備用，然后透射電鏡觀察。

1.2.3 拉伸強(qiáng)度測定 將各組納米纖維剪成5 cm×2 cm條狀，厚度0.5 mm。采用萬能測試機(jī)檢測器拉伸強(qiáng)度，測試參數(shù)為拉伸速率為10 mm/min、溫度為20℃、相對濕度為50%。

1.2.4 接觸角檢測 纖維膜固定在載玻片上，滴加0.5 mL ddH2O，用顯微鏡頭捕捉液滴在材料表面伸展的圖像，然后用軟件分析接觸角的圖像。

1.2.5 細(xì)胞在纖維膜的粘附及形態(tài) 接種12 h后，采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架，4′、6-二脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 標(biāo)記細(xì)胞核，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在納米支架的伸展及粘附情況。

1.2.6 細(xì)胞毒性檢測 MC3T3-E1細(xì)胞以2×103/孔的密度接種在96孔板(已放入支架材料)，到預(yù)定時間點(1天、4天、7天)，棄原培養(yǎng)液，將10 μL的CCK-8液加入到孔板中，每組5個復(fù)孔，37℃孵育4 h。然后吸取上清到另一新96孔板中，利用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測吸光度值(OD)。設(shè)置一個空白組(未加細(xì)胞及支架材料)，一個對照組(含有細(xì)胞，不加支架材料)。

1.2.7 堿性磷酸酶檢測 將MC3T3-E1細(xì)胞按照1×105/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板(已放入支架材料)。培養(yǎng)基為含有誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基，隔2天換液。誘導(dǎo)7天、14天、21天后，分別取樣檢測405 nm處的吸光度值，以PCL組為陰性對照，每個樣品設(shè)三個復(fù)孔。

1.2.8 RT-PCR檢測RUNX2基因表達(dá) 骨誘導(dǎo)7天、14天、21天時，剪碎接種有細(xì)胞的支架，Trizol提取細(xì)胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-PCR檢測基因Runx2，引物序列為(5′-3′：CCTTCAAGGTTGTAGCCCTC，3′-5′：GGAGTAGTTCTCATCATTCCCG)。以GAPDH(5′-3′：ACTTTGTCAAGCTCATTTCC，3′-5′：TGCAGCGAACTTTATTGATG)為內(nèi)參計算2-ΔΔCt值，其中ΔΔCt=(實驗組目的基因Ct值-實驗組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)。每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，多組定量資料的t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEM及TEM結(jié)果 電鏡下所示(見圖1)，靜電紡絲呈現(xiàn)無序的三維交錯結(jié)構(gòu)，纖維之間交錯成網(wǎng)狀。純PCL纖維支架材料粗細(xì)較均勻，纖維表面較光滑。聚己內(nèi)酯/nHA的支架有一定的團(tuán)聚，表面略粗糙,其纖維支架直徑略有增粗，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3組靜電紡絲纖維的直徑分別為(550.90±37.43)nm、(617.18±30.17)nm、(630.02±60.53)nm。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。右上角為透射電鏡圖像。

2.2 拉伸強(qiáng)度及接觸角結(jié)果 PCL組親水性較差，聚己內(nèi)酯/nHA支架組的親水性明顯提高,接觸角小于90°(見圖2)。PCL組強(qiáng)度最高，隨nHA的增加，聚己內(nèi)酯/nHA支架組的拉伸強(qiáng)度逐漸降低，均小于PCL組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。40%nHA組拉伸強(qiáng)度最低，均小于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(見圖3)。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。

與PCL組比較，*P<0.05；與30% nHA組比較，#P<0.05。

2.3 細(xì)胞的粘附生長 細(xì)胞在纖維膜表面充分伸展，偽足較多(見圖4)。與PCL組相比，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組(30%nHA組、40%nHA組)細(xì)胞粘附生長的數(shù)量明顯提高(P<0.05)(見圖5)；聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組可明顯提高細(xì)胞在支架表面的生長增殖。

A. PCL組；B. 30%nHA組；C. 40%nHA組。

與PCL組比較，*P<0.05。

2.4 CCK-8和ALP結(jié)果 CCK-8檢測結(jié)果顯示接種第4、7天時，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組的OD值高于純聚內(nèi)酯組(P<0.05)，其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

與PCL組比較，*P<0.05。

ALP檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞接種14天、21天時聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組的ALP水平明顯高于純聚己內(nèi)酯組及空白對照組，P<0.05(圖7)。聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石纖維膜可促進(jìn)ALP的表達(dá)。

與空白組和PCL組比較，*P<0.05。

2.5 RT-PCR結(jié)果 細(xì)胞接種7天、14天時，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組RUNX2 mRNA的表達(dá)明顯高于純PCL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞接種21天時，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組RUNX2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于純PCL組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其余組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果說明，RUNX2在MC3T3-E1細(xì)胞的成熟分化的早期高表達(dá)，在晚期低表達(dá)，這種趨勢在聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組較明顯。見表8。

與空白組和PCL組比較，*P<0.05。

3 討論

靜電紡絲技術(shù)基本原理是在高壓電場作用下，帶電液體通過電場并拉伸形成一個向收集器噴射的稀薄液體噴射流，該液體多為聚合物溶液，其中溶劑在噴射過程中蒸發(fā)，聚合物溶液連續(xù)噴射，形成連續(xù)交聯(lián)的纖維支架結(jié)構(gòu)，其直徑一般在10 nm到10 μm之間[5]。與相分離、泡沫法、凍干法等三維支架的制備技術(shù)相比，靜電紡絲制取方法具有易操作、取材方便、參數(shù)可控等優(yōu)點，是制備支架材料常用的方法。已有學(xué)者使用靜電紡絲技術(shù)將nHA與有機(jī)聚合物(PLGA、PVA等)結(jié)合形成三維纖維支架而nHA的活性未被破壞[6]。本研究在借鑒其他學(xué)者研究的基礎(chǔ)，嘗試將nHA嵌入PCL纖維支架，構(gòu)建具有骨傳導(dǎo)性纖維支架復(fù)合材料。 聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組直徑略有變大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗采用的羥基磷灰石的直徑較小(300～450 nm)，納米羥基磷灰石在纖維內(nèi)部的重疊聚集可導(dǎo)致纖維直徑略有增大。透射電鏡結(jié)果顯示，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組有明顯的納米羥基磷灰石重疊影像，纖維表面較粗糙[7]。有學(xué)者的研究表明纖維表面粗糙度的增加受纖維直徑增大的影響，這與本研究的結(jié)果是一致的[8]。有學(xué)者研究指出隨機(jī)取向制備nHA嵌入的纖維支架可影響支架材料表面的粗糙度，本研究采用隨機(jī)取向制備纖維在一定程度增加了材料表面的粗糙度[9]。聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組的拉伸強(qiáng)度降低，這可能與nHA的加入引起納米纖維連續(xù)性降低及單位面積的聚內(nèi)酯的量減少有關(guān)[10]。研究表明，nHA過多可導(dǎo)致靜電紡絲溶液的粘稠度增加，導(dǎo)致相同靜電紡條件下更易出現(xiàn)纖維的斷裂，從而可能導(dǎo)致纖維支架拉伸強(qiáng)度的降低[10]。

親水性是細(xì)胞在支架材料表面粘附生長的基礎(chǔ)，純PCL組的纖維疏水性較強(qiáng)，不利于細(xì)胞的粘附生長。接觸角的結(jié)果顯示，在滴加液體3 min后，聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組接觸角明顯降低小于90°,說明其纖維膜材料潤濕性好，具有良好的親水性。這可能與納米羥基磷灰石具有親水性的羥基，從而導(dǎo)致材料的潤濕性提高[10]。

聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石組有利于MC3T3-E1細(xì)胞的粘附生長。一方面復(fù)合支架材料表面粗糙度較高可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在支架表面的粘附生長，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果是一致的[11]。另一方面，納米羥基磷灰石的加入改善復(fù)合支架材料表面的潤濕性，研究表明細(xì)胞在親水性的材料表面更容易粘附生長增殖[12]。此外，另一學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)納米羥基磷灰石可與細(xì)胞的RGD多肽結(jié)合發(fā)揮作用進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的粘附增殖[11]。

成骨相關(guān)基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的表達(dá)可提示MC3T3-E1細(xì)胞的增殖成熟分化情況。既往研究表明RUNX2在細(xì)胞分化過程中高表達(dá)，一旦細(xì)胞成熟后其表達(dá)水平明顯降低[10]。實驗結(jié)果說明聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石復(fù)合支架材料可明顯地促進(jìn)MC3T3-E1成骨向的分化、成熟及礦化，且nHA含量越多其促進(jìn)作用更顯著。

本研究成功制備出富含nHA的復(fù)合聚己內(nèi)酯支架材料，并對其理化表征、生物學(xué)性能及成骨性能進(jìn)行檢測，可見制備的材料支架具有較理想的理化表征，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖，說明富含納米羥基磷灰石的靜電紡絲支架是一種具有良好潛能的骨組織工程支架，在后續(xù)的研究中將在動物實驗中使用該復(fù)合靜電紡絲支架進(jìn)行骨修復(fù)，進(jìn)一步驗證材料的性能。