李建衛(wèi) 李煥煥 楊 勇 張 培 黃玉梅

1 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科 山東 濱州 256603；3 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔修復科 山東 濱州 256603

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)不僅具有多向分化潛能，同時因其具有取材方便，來源廣泛和易于培養(yǎng)等優(yōu)點成為了越來越多研究者的選擇對象[1-3]。前期有研究發(fā)現(xiàn)應力刺激能夠促進ADSCs的骨向分化[4]，但是力學作用下ADSCs骨向分化的分子機制還不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類堿基長度約為22 bp的內(nèi)源性非編碼蛋白小分子RNA，通過識別mRNA的3′-非翻譯區(qū)抑制其翻譯而參與調(diào)控一系列的生命活動[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)并證實了多個miRNA在間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的調(diào)控作用[7-9]。目前關(guān)于機械應力加載下ADSCs骨向分化過程中相關(guān)miRNA表達模式的研究較少。本研究采用四點彎曲細胞加力裝置對細胞施加單一周期的張力刺激誘導骨向分化，篩選力學作用下成骨分化相關(guān)的miRNA，并探討其在力學刺激不同時間點的表達模式，為進一步研究應力下成骨相關(guān)miRNA的功能及力學信號轉(zhuǎn)導機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器 C57BL/6小鼠由濱州醫(yī)學院實驗動物中心提供。Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)，成骨誘導培養(yǎng)基、成脂誘導培養(yǎng)基(Cyagen 公司，美國)，總RNA提取Trizol試劑、α-MEM培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit、PCR反應試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司，大連)，miRNA標記試劑盒miRCURYTMPower labeling kit、miRNA芯片miRCURYTMLNA Array(Exiqon公司，丹麥)，紫外分光光度計(Nanodrop公司，美國)，GenePix 4000B芯片掃描儀、GenePix Pro 6.0圖像分析軟件(Axon Instruments公司，美國)。成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、Ⅰ型膠原蛋白(type I collagen, Col1)、骨鈣素(Osteocalcin, OCN)以及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設計合成，其序列見表1。

表1 mRNA引物序列

1.2 小鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下取6周齡雄性C57BL/6小鼠雙側(cè)腹股溝處的脂肪組織，PBS沖洗3次后將其剪碎至乳糜狀。按照體積比1∶1加入0.2%的Ⅰ型膠原酶充分混合，置恒溫搖床37 ℃消化40 min后加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中止消化。100 μm尼龍濾網(wǎng)過濾，1 000 r·min-1離心8 min，棄去上清液。所獲細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后更換培養(yǎng)基，細胞融合達70%～80%時用0.25%的胰蛋白酶消化細胞傳代。取第3代ADSCs進行成骨及成脂誘導分化，成脂誘導1周后行油紅O染色觀察脂滴，成骨誘導2周后行茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)。

1.3 細胞加力 將第3代小鼠ADSCs分為實驗組和對照組。采用四點彎曲加力儀對實驗組ADSCs進行加力。將75 cm2細胞培養(yǎng)瓶制作成3 cm×8 cm大小的細胞加力板，第3代ADSCs消化后調(diào)整細胞密度為2×105個·mL-1，將l mL細胞懸液均勻接種于加力板上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在加力培養(yǎng)皿內(nèi)加力。加力儀加力參數(shù)設置為位移1 mm，頻率為0.5 Hz，此時細胞受力2 000 με(μstrain，微應變)，每天加力2 h。對照組細胞在相同孵箱內(nèi)培養(yǎng)但不加力。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測成骨相關(guān)基因mRNA 實驗組及對照組細胞分別于處理1、3、5、7 d后收獲細胞，利用 Trizol 試劑按說明書要求提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測量其濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒在Bio-Rad iQ5系統(tǒng)上進行實時定量PCR反應。反應條件：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法分析2組細胞1、3、5、7 d的ALP、Runx2、OCN及Col1 mRNA相對表達量。

1.5 基因芯片技術(shù)篩選力學刺激誘導ADSCs骨向分化過程中成骨相關(guān)miRNA Trizol法提取實驗組和對照組細胞第5天總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA 260 nm/RNA 280 nm的光密度值以檢測RNA樣品的純度和濃度；用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA純度及完整性。使用miRNA標記試劑盒，用標記酶將Hy3TM熒光基團標記兩細胞樣本的miRNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針；使用雜交儀將標記好的探針與miRCURYTM芯片進行雜交，雜交后采用GenePix 4000B芯片掃描儀讀取芯片圖像的原始信號強度，并用GenePix Pro 6.0圖像分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。表達變化在2倍以上認為是顯著差異變化的miRNA。

1.6 成骨相關(guān)miRNA的檢測 選取第3代ADSCs進行細胞加力實驗，分別取加力第0、3、5、7 d的細胞提取總RNA。因miRNA序列較短，難以采用常規(guī)方法設計PCR引物，本實驗中設計相應的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再利用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時定量PCR反應，以U6作為內(nèi)參計算各成骨相關(guān)miRNA在不同時間點的表達強度。相關(guān)mmu-miRNA及內(nèi)參U6正反向引物序列見表2， miRNA反向引物可與正向引物部分配對，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠ADSCs的鑒定 電子顯微鏡下可見典型的小鼠ADSCs呈短梭形，3代細胞培養(yǎng)3～5 d后，細胞生長旺盛，呈明顯的集落狀生長(圖1A)。第3代ADSCs成骨誘導14 d后茜素紅染色發(fā)現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)(圖1B)，成脂誘導7 d后油紅O染色發(fā)現(xiàn)明顯脂滴(圖1C)。

表2 miRNA引物序列

A.第3代ADSCs細胞形態(tài) 電子顯微鏡 ×40；B.茜素紅染色圖像 ×100；C.油紅O染色 ×100。

2.2 成骨相關(guān)基因 mRNA的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果見圖2，統(tǒng)計分析表明，與不加力組相比，加力組細胞OCN mRNA水平在加力的5、7 d顯著增高，ALP mRNA水平在加力的3、5 d顯著增高， Col1 mRNA水平在加力1、3、5、7 d顯著增高，Runx2 mRNA水平在加力3、5、7 d顯著增高(P<0.05)。

圖2 兩組細胞在不同時間點的成骨相關(guān)基因OCN、ALP、Col1及Runx2的表達

2.3 基因芯片篩選成骨相關(guān)miRNA 紫外分光光度計檢測A260 nm/A280 nm為1.8～2.0，電泳檢測RNA帶顯示28 S、18 S條帶清晰(圖3)，表明RNA質(zhì)量較好。通過miRNA芯片實驗篩選，在機械牽張力促進ADSCs骨向分化過程中顯著差異表達miRNA共有11個，其中表達上調(diào)5個，表達下調(diào)6個。表達上調(diào)的miRNA分別為mmu-miR-300-5p(2.33)、mmu-miR-290a-3p(3.45)、mmu-miR-669c-3p(3.62)、mmu-miR-1895(2.49)、mmu-miR-763(3.08)，表達下調(diào)的miRNA分別為mmu-miR-214-3p(0.37)、mmu-miR-140-5p(0.46)、mmu-miR-30d-3p(0.41)、mmu-miR-26a-5p(0.46)、mmu-miR-335-5p(0.44)、mmu-miR-154-5p(0.42)，括號內(nèi)數(shù)字為表達變化量。

1. 不加力組；2. 加力組。

2.4 成骨相關(guān)miRNA在加力進程中的表達 在6個表達下調(diào)miRNA中，miR-214-3p、miR-140-5p、miR-30d-3p及miR-154-5p在加力過程中呈持續(xù)降低趨勢，其中第5天的變化最顯著(圖4)；miR-26a-5p及miR-335-5p的表達在第3天時降至最低水平，第5、7天有一定程度上升。在5個表達上調(diào)的miRNA中，miR-763于加力的第3天升至最高水平， miR-290a-3p于加力的第5天升至最高水平，其后有一定程度下降趨勢；其余3個miRNA均成持續(xù)上調(diào)趨勢(圖5)。

圖4 加力第0、3、5、7天成骨相關(guān)下調(diào)miRNA 的相對表達強度

3 討論

機械力學刺激在骨的形成及改建過程中具有重要作用[10-12]，ADSCs細胞能夠感應機械力學刺激信號并將其轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生物學信號，適當?shù)膽Υ碳は履軌蚣铀貯DSCs細胞骨向分化的進程[4,12]。但是有關(guān)ADSCs力轉(zhuǎn)導的確切機制并不清楚。已有研究證實miRNA在成骨分化和骨形成過程中起著重要的調(diào)控作用[7-9]，但是目前關(guān)于機械應力加載下ADSCs骨向分化過程中相關(guān)miRNA表達的研究報道較少。

圖5 加力第0、3、5、7天成骨相關(guān)上調(diào)miRNA 的相對表達強度

本實驗在驗證ADSCs的多向分化潛能之后，將其分為加力組及不加力組，對加力組進行張應力刺激，在不同的時間點利用qRT-PCR檢測成骨相關(guān)mRNA的表達，結(jié)果顯示ADSCs經(jīng)張應力刺激后，成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、Col1和OCN mRNA表達水平總體高于對照組，提示本實驗機械牽張力可促進ADSCs的骨向分化。

本實驗利用miRNA基因芯片，分析第5天實驗組及對照組細胞miRNA基因表達譜，篩選出在力學刺激誘導ADSCs成骨分化過程中表達變化明顯的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個miRNA表達上調(diào)，6個miRNA表達下調(diào)。ADSCs骨向分化過程中miR-300-5p、miR-290a-3p、miR-669c-3p、miR-1895、miR-763表達上調(diào)，正向參與力學刺激下ADSCs成骨分化，結(jié)合miRNA與靶向mRNA的抑制機制，此5個miRNA的靶基因mRNA在ADSCs骨向分化中表達下調(diào)，相關(guān)靶基因蛋白為骨向調(diào)控的負性因子；ADSCs骨向分化過程中miR-214-3p、miR-140-5p、miR-30d-3p、miR-26a-5p、miR-335-5p、miR-154-5p表達下調(diào)，負向參與力學刺激下ADSCs成骨分化，此6個miRNA的靶基因在ADSCs骨向分化中表達上調(diào)，相關(guān)靶基因蛋白為骨向調(diào)控的正性因子。同時本研究采用qRT-PCR技術(shù)，在張應力刺激的不同時間點，檢測各miRNA的相對表達強度。結(jié)果顯示：成骨相關(guān)miRNA 在加力的第3天即出現(xiàn)差異性變化，多數(shù)miRNA在加力過程中呈持續(xù)上調(diào)或下調(diào)趨勢，在第5天時差異性最顯著；但miR-26a-5p、 miR-335-5p及miR-763的表達在第3天時差異性最顯著，其后又有一定程度的反調(diào)。提示加力刺激的第5天是miRNA調(diào)控的關(guān)鍵時間，多數(shù)miRNA發(fā)生顯著變化，miR-26a-5p、 miR-335-5p及miR-763可能參與力學促進成骨的早期調(diào)控。

本研究證實適當應力刺激可促進ADSCs骨向分化，并篩選出應力下11個與成骨分化相關(guān)的miRNA，并初步探討了其在張應力刺激不同時間點的表達模式。后續(xù)研究中將進一步研究相應miRNA的靶基因，生物信息學分析miRNA的靶向mRNA及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵分子，雙熒光素酶試驗驗證其靶向調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建上調(diào)下調(diào)miRNA表達的慢病毒載體，感染ADSCS進一步研究mRNA、信號通路關(guān)鍵分子、成骨相關(guān)指標的變化。探索miRNA對成骨功能的影響及其參與力轉(zhuǎn)導的分子調(diào)控機制。