吳 蕩，刁衛(wèi)平，王述彬，劉金兵，潘寶貴，隋益虎

(1 安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽233100；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

辣椒(CapsicumannuumL.)作為一種重要的蔬菜作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。其生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到病害及非生物脅迫因素的影響，從而影響品質(zhì)和產(chǎn)量[2-5]。為了降低這些影響，植物進(jìn)化出一套抵御外界脅迫的反應(yīng)機(jī)制，即通過轉(zhuǎn)錄因子整合外界信號和基因調(diào)控的方式產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白和代謝產(chǎn)物來適應(yīng)脅迫，從而提高植物的抗逆性[6]。

NAC是近年來發(fā)現(xiàn)的植物獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族[7-8]。它的命名來源于矮牽牛NAM(No Apical Meristem)基因和擬南芥ATAF1/2基因以及CUC2(cup-shaped-cotyledon)基因的首字母。1997年，Aida等[9]首先報(bào)道并命名了NAC結(jié)構(gòu)域，所有的NAC轉(zhuǎn)錄因子N端都含有一個(gè)高度保守NAC結(jié)構(gòu)域，它由150～160個(gè)氨基酸組成，分為A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。NAC轉(zhuǎn)錄因子還有一個(gè)可充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的高度多樣化的C端序列，因此NAC蛋白可能表現(xiàn)不同的功能[10]。最早在水稻中把NAC轉(zhuǎn)錄因子家族分為3個(gè)亞族(NAM、OsNAC3和ATAF)為Ⅰ族[11]，Ooka等[12]根據(jù)NAC結(jié)構(gòu)域的相似性又將NAC轉(zhuǎn)錄因子家族分為第Ⅰ和Ⅱ兩大族，其后進(jìn)一步根據(jù)自展支持率對其分別細(xì)分為14個(gè)和4個(gè)亞族。隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展和大量研究結(jié)果的發(fā)表，發(fā)現(xiàn)NAC基因家族中有一些基因同時(shí)參與生物和非生物脅迫反應(yīng)。其中水稻OsNAC5、OsNAC9和OsNAC10基因的超表達(dá)，不僅可以提高水稻的產(chǎn)量，還可以提高水稻的抗旱性[13-14]。番茄StNAC基因在致病疫霉菌的侵染下誘導(dǎo)表達(dá)[15]。然而，當(dāng)前關(guān)于辣椒NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究并不太多。CaNAC1的表達(dá)不僅受到病原菌的快速特異誘導(dǎo)，還受到外源水楊酸和乙烯的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[16]。CaNAC2和CaNAC23的表達(dá)均受到干旱和鹽害等非生物脅迫的誘導(dǎo)[17-18]。CaNAC036和CaNAC72均是通過JA/ET信號傳導(dǎo)途徑參與青枯病菌侵染的防御反應(yīng)[19-20]。CaNAC45和CaNAC61在辣椒逆境脅迫方面起到了重要作用[21-22]。

項(xiàng)目組前期在辣椒全基因組水平上共鑒定到104個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，依次命名為CaNAC1～CaNAC104[23]，本試驗(yàn)以CaNAC55為研究對象，選用高抗疫病辣椒材料CM334為試材，分析轉(zhuǎn)錄因子的序列結(jié)構(gòu)以及在不同生物和非生物脅迫下的表達(dá)模式，為后續(xù)深入研究NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料準(zhǔn)備

挑取籽粒飽滿種子用紗布包好，55 ℃熱水浸種20 min，然后在室溫條件下讓種子充分吸水6～8 h，最后播種于72孔穴盤中，每穴1～2粒種子。子葉出土后，將幼苗轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中長日照條件下生長(16 h光照，8 h黑暗)，溫度為26 ℃(晝)/18 ℃(夜)，當(dāng)辣椒幼苗有6片真葉時(shí)，用于脅迫處理。

1.2 方 法

1.2.1 脅迫處理利用本課題組已建立的辣椒疫霉菌接種體系[24]對幼苗進(jìn)行接種，向在V8培養(yǎng)基培養(yǎng)的疫霉菌中加入15 mL滅菌超純水，將培養(yǎng)皿于4 ℃放置30～40 min，再取出室溫放置30 min左右，在顯微鏡下觀察游動(dòng)孢子，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整其濃度為1×105spores/mL備用，分別將幼苗放入光照強(qiáng)度為160 μmol·m-2·s-1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行脅迫處理。利用事先備好的1×105spores/mL疫霉菌對幼苗進(jìn)行接種；將幼苗根洗凈后分別放置在300 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇溶液中進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫處理；將幼苗放入42 ℃條件下的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行熱激脅迫處理；分別利用100 mmol/L ABA、SA、MeJA溶液噴施辣椒葉面，用無菌水噴灑作對照[25]，分別于處理0、3、6、12和24 h取樣，液氮速凍，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆?，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2.2 基因克隆在茄科基因組數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)中下載已有CaNAC55基因序列，并根據(jù)序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表1)，委托擎科生物技術(shù)有限公司(南京)合成。以CM334材料的cDNA和gDNA作為擴(kuò)增模板，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳(110 V，30 min)檢測PCR產(chǎn)物，質(zhì)量合格后回收相應(yīng)的gDNA片段，回收片段克隆至pClone007載體(TsingKe，南京)，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑選陽性單克隆送擎科生物技術(shù)有限公司(南京)測序，得到目的片段序列。

表1 所用引物信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用ORFfinder程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.ht-ml)對CaNAC55基因進(jìn)行開放閱讀框(ORF)預(yù)測；根據(jù)克隆所得的cDNA序列，利用NCBI的Blastp在線分析工具對氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，并結(jié)合IQTREE構(gòu)建分子進(jìn)化樹。同時(shí)，選取擬南芥、水稻和辣椒不同亞家族NAC轉(zhuǎn)錄因子(ANAC011，ANAC022，ANAC029，ANAC055，ANAC078，ANAC083，ANAC084，ANAC090，ANAC091，ANAC098，ONAC022，ONAC074，CaNAC045，CaNAC046，CaNAC100)進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.4CaNAC55在脅迫下的表達(dá)分析提取辣椒葉片總RNA，并按照試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(TaKaRa，大連)。根據(jù)辣椒CaNAC55序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)，以辣椒Actin(GenBank登錄號為GQ339766)作為內(nèi)參基因[26]，引物由擎科生物技術(shù)有限公司(南京)合成。采用德國羅氏診斷有限公司的LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，反應(yīng)體系(25 μL)包括2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、10 mmol/L上下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL(100 ng/μL)，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法計(jì)算CaNAC55的相對表達(dá)量[25]，采用Excel進(jìn)行平均數(shù)統(tǒng)計(jì)，以SPASS軟件進(jìn)行方差分析，繪制RT-PCR分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaNAC55基因的克隆

利用引物CaNAC55F/CaNAC55R(表1)分別對辣椒高抗疫病材料CM334的gDNA和cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得4 100 bp和1 200 bp左右的片段(圖1)，將兩種目的片段切膠回收后連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆用特異性引物檢測后送于南京擎科生物科技有限公司測序，并用DNAMAN軟件進(jìn)行序列驗(yàn)證。結(jié)果顯示，以gDNA和cDNA為模板的目的片段與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中序列完全一致，大小分別為4 164和1 299 bp，該基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG之間具有一個(gè)1 299 bp的完整開放閱讀框(ORF)(圖2)，其基因編碼的蛋白由432個(gè)氨基酸殘基組成。

圖1 辣椒CaNAC55基因PCR擴(kuò)增 Fig.1 PCR amplification of CaNAC55 gene in pepper

圖2 CaNAC55 cDNA序列及預(yù)測氨基酸序列Fig.2 CaNAC55 nucleotide sequence and predicted amino acid sequence

2.2 辣椒CaNAC55序列比對

對辣椒CaNAC55基因的氨基酸序列使用NCBI中的Blastp進(jìn)行同源性檢索，應(yīng)用DNAMAN軟件對番茄、煙草、馬鈴薯等11種NAC家族代表性植物進(jìn)行NAC多序列比對(圖3)。同時(shí)，利用IQTree軟件將CaNAC55與擬南芥、水稻和辣椒中不同亞族進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，根據(jù)NAC家族分類特點(diǎn)可知，CaNAC55屬于NAC家族第Ⅰ族中的TIP亞族(圖4)。

圖3 NAC55多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NAC55

圖4 辣椒CaNAC55氨基酸與擬南芥(ANAC)、水稻(ONAC)和辣椒(CaNAC)不同亞族構(gòu)建進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of CaNAC55 amino acid sequences from pepper and other species from different subfamilies of Arabidopsis thaliana (ANAC), rice (ONAC) and rice (CaNAC)

2.3 辣椒CaNAC55進(jìn)化樹分析

使用NCBI中Blastp工具對辣椒CaNAC55基因序列進(jìn)行同源檢索，利用IQTree軟件對檢索到的數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果表明，辣椒CaNAC55基因與辣椒Capsicumannuum(XM-016722474)、番茄Solanumlycopersicum(XM-004241285)、馬鈴薯Solanumtuberosum(XM-006361027)親緣關(guān)系最近，相似性依次達(dá)到99.87%、93.37%和92.62%。推測CaNAC55基因的功能可能與馬鈴薯、番茄中的同源基因功能相似。

2.4 辣椒CaNAC55對脅迫的應(yīng)答

鹽害、干旱、熱激等非生物脅迫均能誘導(dǎo)CaNAC55基因的表達(dá)(圖6)。研究結(jié)果顯示，CaNAC55基因在高鹽處理下的相對表達(dá)量呈顯著上升趨勢，在處理后24 h達(dá)到峰值，表達(dá)量為對照的20.92倍。在干旱處理下的相對表達(dá)量呈波浪型變化趨勢，在3 h表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照的2.23倍，隨后迅速降低至最低后上升，在24 h表達(dá)量達(dá)到最大峰值，為對照的3.01倍(圖6)。CaNAC55基因在42 ℃熱激脅迫處理3 h后表達(dá)量迅速降低，隨后迅速升高，在12 h表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的8.84倍(圖6)。結(jié)果顯示，辣椒CaNAC55基因在高鹽、干旱、熱激等非生物脅迫下表達(dá)量均表現(xiàn)一定程度上調(diào)，高鹽脅迫處理下基因表達(dá)上調(diào)最為顯著，可能在辣椒相應(yīng)鹽脅迫過程中起著重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)辣椒CaNAC55基因同樣受到激素脅迫的影響，在ABA處理下，CaNAC55基因的相對表達(dá)量均低于對照組，說明CaNAC55基因的表達(dá)受到ABA的抑制。在SA、MeJA、phyto等脅迫處理下CaNAC55基因相對表達(dá)量與對照組相比無明顯變化。

圖5 辣椒CaNAC55基因與GenBank中相似序列的進(jìn)化樹分析Fig.5 Conserved domain in phylogenetic tree analysis between pepper CaNAC55 gene and similar sequences in GenBank

不同小寫字母表示在同一脅迫處理下差異顯著圖6 辣椒CaNAC55基因在不同非生物脅迫中的表達(dá)Differentl letters showed significant difference under the same stress treatmentFig.6 Relative expression of CaNAC55 gene of pepper with different abiotic stress treatments

3 討 論

植物生長發(fā)育過程中會(huì)面臨各種逆境脅迫，前人研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子家族不僅在抵抗逆境脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中也起著相關(guān)作用。在鹽脅迫方面，棉花中的GmNAC4通過維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡來提高耐鹽性[27]；利用酵母單雜系統(tǒng)在擬南芥中分離出3個(gè)不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC055、ANACO19和ANAC072，高鹽、干旱、ABA依次誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[28-30]；有研究表明在鹽和干旱脅迫條件下，辣椒CaNAC23基因的表達(dá)量會(huì)上升[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽處理下辣椒CaNAC55基因的表達(dá)量呈顯著上升趨勢，其表達(dá)模式與前人研究結(jié)果基本一致，推測CaNAC55基因可能在辣椒響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。干旱脅迫下，苦芥FtNAC17基因表達(dá)量呈波浪型變化，可能與多個(gè)基因協(xié)同響應(yīng)干旱脅迫有關(guān)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CaNAC55基因的表達(dá)量隨著干旱處理時(shí)間的增加也呈波浪型變化趨勢，推測辣椒CaNAC55基因可能與苦芥FtNAC17基因響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制相同。在熱激脅迫方面，紀(jì)康[32]對高羊茅種質(zhì)進(jìn)行了耐熱激能力評價(jià)后，從中鑒定出一個(gè)受熱激顯著誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子FaNAC72。CaNAC55基因在熱激處理后表達(dá)量與對照組相比增幅較大，處理12 h表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的8.84倍。研究結(jié)果表明，辣椒CaNAC55基因的表達(dá)受到高鹽、干旱、熱激等非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

前人研究表明，苦蕎FtNAC11基因通過調(diào)節(jié)SA、MeJA、ABA等信號，使其在苦蕎響應(yīng)非生物脅迫中起到負(fù)調(diào)控作用[33]。SaNAC36基因也在互花米草響應(yīng)非生物脅迫過程中主要起到負(fù)調(diào)控的作用[34]。辣椒幼苗在ABA處理后，CaNAC55基因的表達(dá)量均低于對照組，該研究結(jié)果與前人一致。推測辣椒CaNAC55基因的表達(dá)受到激素ABA的抑制，使其在辣椒響應(yīng)非生物脅迫中起到負(fù)調(diào)控的作用。在SA、MeJA、phyto等脅迫處理下CaNAC55基因表達(dá)量與對照組相比無明顯變化。因此，SA、MeJA、phyto等因素不直接參與該基因的代謝調(diào)控過程。

CaNAC1的表達(dá)受到病原菌、水楊酸和乙烯等脅迫的誘導(dǎo)[16]；CaNAC2和CaNAC23的表達(dá)受到干旱、鹽害等非生物脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[17-18]；CaNAC036和CaNAC72在調(diào)控青枯病菌侵染的防御反應(yīng)過程中起到了重要作用[19-20]；CaNAC45和CaNAC61的研究為深入探討該基因在生物代謝過程中的功能奠定了理論基礎(chǔ)[21-22]。本項(xiàng)目組前期在全基因組水平上共鑒定104個(gè)辣椒NAC轉(zhuǎn)錄因子[23]，本研究發(fā)現(xiàn)CaNAC55轉(zhuǎn)錄因子對不同逆境脅迫響應(yīng)不同，推測辣椒CaNAC55基因可能作為重要的調(diào)節(jié)因子參與辣椒不同逆境脅迫響應(yīng)。相信隨著現(xiàn)代測序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，越來越多植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員將被鑒定和發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而通過對NAC轉(zhuǎn)錄因子的深入研究來提高作物的抗逆性，促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展。