馬天意，張時(shí)通，朱巍巍，張梅娟，李瑩瑩，彭疑芳，沙 偉

(1 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江齊齊哈爾 161006; 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030)

干旱是頻發(fā)的全球性自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重威脅植物的生存和生長(zhǎng)，導(dǎo)致糧食產(chǎn)量下降[1]。中國(guó)糧食生產(chǎn)過(guò)程中遭受到的干旱災(zāi)害尤為嚴(yán)重，多年來(lái)中國(guó)農(nóng)業(yè)干旱受災(zāi)面積約占總自然災(zāi)害受災(zāi)面積的一半左右，干旱導(dǎo)致的農(nóng)作物種植面積縮減問題直接制約了糧食的增產(chǎn)速度[2-3]。利用環(huán)境干旱脅迫已經(jīng)篩選出了許多具有抗旱性的植物物種，再利用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)手段從具有抗旱能力的植物中尋找能夠提高植物抗旱性的基因，借以培育新的抗旱作物品種，是使植物適應(yīng)干旱環(huán)境生長(zhǎng)的一種行之有效的方法[4]。

砂蘚(Racomitriumcanescens)為紫萼蘚科(Grimmiaceae)砂蘚屬(Racomitrium)植物，廣泛分布于各種生境，是黑龍江省五大連池地區(qū)火山熔巖地貌的優(yōu)勢(shì)種[5]，也在中國(guó)大部分地區(qū)廣泛分布[6]。早在幾十年前就已經(jīng)證實(shí)砂蘚是具有耐脫水性的蘚類植物[7]，干燥數(shù)年的砂蘚材料可在復(fù)水后數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，在植物抗旱性和耐脫水性機(jī)制研究方面顯示出較高的利用價(jià)值[8]，砂蘚中與強(qiáng)耐脫水性功能相關(guān)的基因可能具有提高植物抗旱能力的作用。在早期研究中，對(duì)正常生長(zhǎng)的砂蘚材料進(jìn)行了24 h的快速脫水處理，使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)尋找可能參與砂蘚耐脫水性響應(yīng)的功能基因，并試圖探討這些基因提高植物抗旱性的能力。對(duì)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)基因進(jìn)行了初步的研究，其中砂蘚的ATP合酶Ⅱ亞基基因RcatpG[9]、生長(zhǎng)素受體基因RcTIR1[10]、超氧化物歧化酶基因RcSOD[11]、丙二烯氧化物環(huán)化酶基因RcAOC1[12]、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因RcMYB[13]、bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因RcbZIP1[14]、過(guò)氧化氫酶基因RcCAT[15]和小G蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)基因RcRAB[16]的表達(dá)在各種脫水和復(fù)水處理中發(fā)生了變化，而且使用RcMYB構(gòu)建的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草獲得了更強(qiáng)的耐旱性和復(fù)水能力[17]。這些研究結(jié)果表明砂蘚中的基因資源能夠用來(lái)提高植物的抗旱能力，很多基因抗旱功能有待于被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。

近期報(bào)道了砂蘚中一個(gè)被注釋為磷脂酶D(phospholipase D, PLD)的編碼基因RcPLD能夠在砂蘚的不同脫水和復(fù)水處理中發(fā)生顯著的差異表達(dá)，通過(guò)對(duì)該基因的編碼序列克隆和序列基本特征分析[8]，初步證實(shí)RcPLD可能參與砂蘚的耐脫水脅迫響應(yīng)。

PLD的生物化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯酶，其根據(jù)水解磷脂時(shí)的不同作用位置被分為磷脂酶A1、A2、B、C、D等5類[18]。這些磷酸二酯酶能夠?qū)⒘字鉃槎８视?、乙酰膽堿、磷脂酸和三磷酸肌醇等產(chǎn)物，這些水解產(chǎn)物都能夠作為第二信使在植物細(xì)胞的各種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[19]。典型的PLD具有的保守結(jié)構(gòu)域包括2個(gè)PLD家族結(jié)構(gòu)域HKD(HxKxxxxD, domain)、一個(gè)C2(proteinkinase C-conserved-domain 2)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)磷脂酰肌醇二磷酸[phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate, PIP2]結(jié)構(gòu)域及潛在的IYIENQFF結(jié)構(gòu)，少數(shù)PLD會(huì)缺少其中的某些結(jié)構(gòu)域而由其他結(jié)構(gòu)域代替[8]。研究發(fā)現(xiàn)RcPLD所編碼的蛋白質(zhì)序列中僅包含1個(gè)HKD，這種非典型的PLD在之前鮮有報(bào)道，其功能與典型PLD的異同也不得而知。前人發(fā)現(xiàn)，不同植物物種的PLD能夠影響植物的冷脅迫和干旱脅迫耐受能力，并對(duì)其中的作用機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)的研究[20-21]，但苔蘚植物中PLD的相關(guān)研究還較為缺乏，特別是砂蘚的非典型PLD(RcPLD)在環(huán)境脅迫中的具體作用尚不清楚。

因此，本研究使用已克隆得到的RcPLD編碼序列構(gòu)建了過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)株系rcpld-oe，發(fā)現(xiàn)rcpld-oe具有強(qiáng)于野生型擬南芥的干旱脅迫耐受能力，對(duì)不同的擬南芥株系進(jìn)行了基本的生理生化指標(biāo)測(cè)定，以對(duì)RcPLD增強(qiáng)擬南芥抗旱性的機(jī)制進(jìn)行解釋。本研究結(jié)果初步證明了RcPLD可用于提高植物耐旱能力，為更多苔蘚植物抗逆相關(guān)基因資源的研究、開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 RcPLD過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的構(gòu)建

使用前期已連入RcPLD編碼序列的pMD-19T重組質(zhì)粒構(gòu)建RcPLD的過(guò)量表達(dá)載體。在構(gòu)建克隆載體時(shí)已在引物RcPLD-F和RcPLD-R中分別加入限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)(表1)，使用TaKaRa公司(大連)生產(chǎn)的QuickCutSalⅠ和QuickCutEcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)RcPLD的克隆載體和pRI101-AN空表達(dá)載體(TaKaRa，大連)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，回收目的條帶后使用北京索萊寶科技有限公司的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的載體和RcPLD編碼序列進(jìn)行回收，使用TaKaRa公司生產(chǎn)的T4DNA Ligase對(duì)基因和載體片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α株系感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)和篩選鑒定，方法同沙偉等[8]。根據(jù)Kong等方法，將提取后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至實(shí)驗(yàn)室保存的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105后進(jìn)行篩選、鑒定和培養(yǎng)，使用浸花法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的columbia-0(col-0)野生型擬南芥進(jìn)行侵染，使用含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)侵染后獲得的擬南芥種子進(jìn)行篩選，篩選后獲得的植株即為T1代RcPLD過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(rcpld-oe)[22]。

表1 實(shí)驗(yàn)引物序列信息

篩選結(jié)束后將T1代rcpld-oe植株移栽至滅菌的混合土基質(zhì)(蛭石∶草炭土比例為2∶1)中，放置于封閉光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗，(25±1) ℃，空氣相對(duì)濕度45%～55%)。當(dāng)T1代rcpld-oe植株長(zhǎng)出6片真葉時(shí)取1片真葉進(jìn)行基因組DNA提取，以檢測(cè)篩選得到的擬南芥植株中是否插入了RcPLD片段。使用TaKaRa公司生產(chǎn)的DNAiso Reagent試劑對(duì)rcpld-oe和野生型擬南芥植株進(jìn)行DNA提取，提取后將基因組DNA稀釋至100 ng/μL，每植株取100 ng基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：基因組DNA 1 μL，RcPLD-F、RcPLD-R引物各1 μL，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0)反應(yīng)液10 μL，無(wú)菌去離子水7 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。使用等量野生型擬南芥基因組DNA作為陰性對(duì)照，無(wú)菌去離子水作為空對(duì)照，含有RcPLD編碼序列的pRI101-AN重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。

將鑒定含有RcPLD序列的植株繼續(xù)培養(yǎng)，單獨(dú)收集每一株擬南芥植株的種子，然后播種于含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，篩選后的植株移入混合土基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得T2代rcpld-oe植株。在培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)植株生長(zhǎng)至21 d時(shí)，每個(gè)植株剪去4片未衰老的蓮座葉，迅速放入2 mL離心管中，用液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱中保存，供后續(xù)試驗(yàn)中提取RNA。單獨(dú)收集每株T2代rcpld-oe植株的種子，使用含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)種子進(jìn)行篩選，每個(gè)培養(yǎng)基上播種同一植株的50粒種子，每個(gè)植株播種3次，若排除自然萌發(fā)率影響后，同一植株的3次篩選中所有種子都能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，則認(rèn)為該T2代rcpld-oe植株為RcPLD純合體，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。當(dāng)T2代rcpld-oe植株被鑒定為純合體后，使用提前采集并保存的蓮座葉材料進(jìn)行RNA提取，提取方法同沙偉等[8]。用獲得的RNA合成cDNA后，采用qPCR對(duì)材料中RcPLD的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，以擬南芥Actin1(AT2G37620)基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)方法同沙偉等[8]，所用引物序列如表1所示。

1.2 干旱和復(fù)水處理

將消毒后的rcpld-oe純合T3代種子和野生型擬南芥種子同時(shí)播種于1/2 MS平板固體培養(yǎng)基中，消毒方法同Kong等[22]，于4 ℃黑暗條件下春化3 d后移至光照周期為8 h光照/16 h黑暗的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗生長(zhǎng)至具有2片蓮座葉后，將幼苗移至含混合土基質(zhì)的帶托盤花盆中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)植株生長(zhǎng)至播種21 d時(shí)，選取不同擬南芥株系中長(zhǎng)勢(shì)一致的足量植株進(jìn)行干旱脅迫處理。將含植株花盆移至不含水的托盤中進(jìn)行自然干旱處理，同時(shí)以相同培養(yǎng)條件下托盤中正常澆水的相同株系植株作為對(duì)照，此時(shí)設(shè)置為干旱處理的0 d(D0)，隨后每天對(duì)植株的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和圖像采集，每7 d收集一批擬南芥蓮座葉材料，共收集5次(D0、D7、D14、D21、D28)，干旱處理28 d后使用去離子水對(duì)擬南芥植株進(jìn)行復(fù)水處理，此時(shí)記為復(fù)水0 d(R0)，復(fù)水2 d后(R2)觀察植株形態(tài)特征并進(jìn)行圖像采集。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

采集干旱處理中各株系擬南芥的蓮座葉作為生理生化指標(biāo)測(cè)定的材料。使用磺基水楊酸法對(duì)游離脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，使用蒽酮法對(duì)可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定，使用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，使用三氯乙酸/硫代巴比妥酸法對(duì)丙二醛進(jìn)行提取和含量測(cè)定，使用丙酮提取法對(duì)總?cè)~綠素進(jìn)行提取，以上生理生化指標(biāo)測(cè)定和計(jì)算方法及相對(duì)含水量測(cè)定方法如Yin等所述[23]。每個(gè)指標(biāo)的每次測(cè)定中分別使用0.1 g樣品材料，干旱處理和正常生長(zhǎng)條件下的每個(gè)株系的植株均單獨(dú)取樣測(cè)定，測(cè)定均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 20.0軟件對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算分析，所有數(shù)據(jù)用Duncan法進(jìn)行one-way ANOVA計(jì)算分析不同樣品間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RcPLD過(guò)表達(dá)擬南芥純合體株系的構(gòu)建

以前期成功構(gòu)建的RcPLD克隆載體作為模板，構(gòu)建含有RcPLD編碼序列的植物過(guò)量表達(dá)載體。在成功獲得RcPLD表達(dá)載體后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHA105株系中，對(duì)抗生素篩選后的陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定，獲得含有RcPLD表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株(圖1，A)。對(duì)篩選獲得的農(nóng)桿菌菌落進(jìn)一步培養(yǎng)，并用浸花法侵染col-0野生型擬南芥，收集成熟后種子，使用含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選(圖1，B)。提取篩選獲得的植株基因組DNA，用RcPLD的克隆引物來(lái)鑒定RcPLD基因是否已插入篩選得到的植株基因組DNA中，最終獲得3個(gè)T1代RcPLD過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株rcpld-oe-1、rcpld-oe-2和rcpld-oe-3(圖1，C)。

A.含有RcPLD表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液PCR：M.DL2000; 1. pRI101-AN(對(duì)照);2. RcPLD表達(dá)載體; 3-4. 含有RcPLD表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液; B. T1代rcpld-oe植株的抗生素篩選; C. T1代rcpld-oe植株基因組DNA的PCR驗(yàn)證: M. DL2000； 1. 水(對(duì)照)； 2. 野生型擬南芥基因組DNA; 3. RcPLD表達(dá)載體; 4-6. T1代rcpld-oe植株基因組DNA; D. T2代rcpld-oe植株中RcPLD相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR檢測(cè), rcpld-oe-3-17植株中RcPLD的表達(dá)量被定義為100%, 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差, n=3, 誤差線上不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異(P<0.05)，下同; E-G. rcpld-oe純合體株系的篩選：E.野生型擬南芥; F. rcpld-oe-2-10; G. rcpld-oe-3-17圖1 RcPLD過(guò)表達(dá)擬南芥純合體株系的構(gòu)建A. PCR with suspension of Agrobacterium containing RcPLD expression vectors: M. DL2000； 1. pRI101-AN (control); 2. RcPLD expression vector; 3-4. Agrobacterium suspension containing RcPLD expression vectors; B. Screening of T1 generation rcpld-oe plants by antibiotics; C. Genomic DNA PCR identification of T1 generation rcpld-oe plants: M. DL2000; 1. Water (control); 2. Genomic DNA of wild-type Arabidopsis; 3. RcPLD expression vector; 4-6. Genomic DNA of T1 generation rcpld-oe plants; D. qRT-PCR detection of relative expression of RcPLD, RcPLD expression of rcpld-oe-3-17 were defined as 100%, error bars indicate standard deviations, n=3, the different lowercased letters above error bars stand for significant difference among materials at 0.05 level (P<0.05), the same as below; E-G. Screening of rcpld-oe homozygotes: E. Wild-type Arabidopsis; F. rcpld-oe-2-10;G. rcpld-oe-3-17Fig.1 Construction and identification of RcPLD-overexpressed Arabidopsis thaliana homozygote lines

對(duì)3個(gè)過(guò)表達(dá)擬南芥株系繼續(xù)培養(yǎng)，收集其成熟種子并再次進(jìn)行播種和篩選，繼續(xù)培養(yǎng)T2代擬南芥植株的同時(shí)收集蓮座葉材料和種子，使用獲得的T3代種子來(lái)鑒定哪些T2代rcpld-oe株系為RcPLD的純合體株系，對(duì)鑒定為純合體的T2代株系進(jìn)行RNA提取，并對(duì)植株中RcPLD進(jìn)行qPCR檢測(cè)(圖1，D)，部分純合體rcpld-oe株系篩選結(jié)果如圖1，E-G所示。由圖1，D可以看出，野生型(col-0)擬南芥中RcPLD的表達(dá)量可被認(rèn)定為儀器系統(tǒng)誤差，其他所有被檢測(cè)的T2代rcpld-oe植株中都具有較高的RcPLD表達(dá)量。綜合考慮基因表達(dá)量和所獲T3代植株的種子數(shù)量，最終選取rcpld-oe-1-13、rcpld-oe-2-9和rcpld-oe-3-3進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 RcPLD過(guò)表達(dá)擬南芥的耐旱性分析

將野生型(col-0)植株和過(guò)表達(dá)株系rcpld-oe-1-13、rcpld-oe-2-9和rcpld-oe-3-3植株同時(shí)進(jìn)行干旱處理，檢測(cè)RcPLD過(guò)量表達(dá)是否能夠提高擬南芥的干旱脅迫耐受能力。圖2顯示，在正常澆水條件下，擬南芥3個(gè)rcpld-oe株系植株的生長(zhǎng)速率慢于野生型植株，其相同苗齡植株的蓮座葉面積明顯小于野生型植株，且抽薹時(shí)間明顯較晚(圖2，A)。在干旱處理0～21 d，3個(gè)rcpld-oe株系的植株蓮座葉片面積小于野生型植株，而野生型植株又明顯小于其同齡相應(yīng)的正常澆水處理植株；但3個(gè)rcpld-oe株系植株的體積在干旱處理7 d時(shí)大于其正常澆水處理的植株，而在干旱處理14～21 d時(shí)均小于其正常澆水處理的植株(圖2，A、B)。在干旱處理28 d時(shí)，野生型擬南芥已全部死亡，rcpld-oe-1-13和rcpld-oe-2-9植株的生長(zhǎng)受到較低程度的抑制，rcpld-oe-3-3植株受到較高程度干旱抑制，但好于同期野生型擬南芥；復(fù)水2 d后，3個(gè)rcpld-oe株系的植株絕大部分能夠維持生存并繼續(xù)生長(zhǎng)，而野生型擬南芥植株基本無(wú)復(fù)蘇征兆(圖2，B)。以上結(jié)果說(shuō)明RcPLD的過(guò)量表達(dá)使擬南芥的抗旱能力和旱后復(fù)水能力在一定程度上得到了提升。

A．正常澆水處理的擬南芥植株; B．干旱脅迫處理的擬南芥植株：D0、D7、D14、D21、D28分別表示干旱處理0、7、14、21、28 d, R0、R2分別表示復(fù)水處理0、2 d；1-13、2-9、3-3分別代表RcPLD過(guò)表達(dá)株系rcpld-oe-1-13、rcpld-oe-2-9和rcpld-oe-3-3植株。下同圖2 干旱和復(fù)水處理下擬南芥野生型(col-0)和rcpld-oe過(guò)表達(dá)株系的生長(zhǎng)情況A. A. thaliana plants growing under normal watering condition; B. A. thaliana plants growing under drought stress treatments: D0, D7, D14, D21, D28 stand for drought treatment for 0, 7, 14, 21, 28 d, respectively, while R0, R2 stand for rehydration treatment for 0, 2 d, respectively； 1-13, 2-9, 3-3 are representing RcPLD overexpression plants of rcpld-oe-1-13, rcpld-oe-2-9 and rcpld-oe-3-3 lines. The same as belowFig.2 Growth condition of wild-type (col-0) and rcpld-oe Arabidopsis thaliana lines under drought and rehydration treatments

2.3 干旱脅迫過(guò)程中RcPLD過(guò)表達(dá)擬南芥的生理生化指標(biāo)變化特征

RcPLD過(guò)量表達(dá)株系和野生型擬南芥植株蓮座葉基本生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示：正常澆水條件下，野生型和rcpld-oe植株蓮座葉的相對(duì)含水量均能維持在95%以上；在干旱處理過(guò)程中，野生型和rcpld-oe植株蓮座葉的相對(duì)含水量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)都顯著下降，但干旱處理21 d時(shí)rcpld-oe擬南芥相對(duì)含水量的下降幅度顯著低于野生型植株，其中又以rcpld-oe-1-13植株下降幅度最小(圖3，A)。野生型和rcpld-oe植株蓮座葉脯氨酸含量在正常生長(zhǎng)條件下基本無(wú)變化且維持在較低的水平，而在干旱處理過(guò)程中都有顯著的提升，尤其在干旱處理后期迅速大幅度提升，且各rcpld-oe植株在處理7 d時(shí)提升幅度就達(dá)到顯著水平，而野生型植株在處理14 d時(shí)才顯著升高；在干旱處理過(guò)程中，各rcpld-oe植株蓮座葉脯氨酸含量增加幅度始終顯著高于同期野生型擬南芥(圖3，B)。野生型和rcpld-oe株系植株蓮座葉可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量隨著處理時(shí)間的變化趨勢(shì)和幅度基本一致，rcpld-oe-1-13和rcpld-oe-2-9中可溶性糖含量在干旱處理過(guò)程中基本高于野生型擬南芥，可溶性蛋白質(zhì)含量在干旱處理后期顯著高于野生型擬南芥，而rcpld-oe-3-3中的含量低于野生型擬南芥(圖3，C、D)。隨著擬南芥植株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段和逐漸衰老，野生型和過(guò)表達(dá)植株蓮座葉中丙二醛含量都有增加的趨勢(shì)；在正常澆水條件下，野生型植株中丙二醛含量隨著植株的生長(zhǎng)而穩(wěn)定增加，而rcpld-oe植株在生長(zhǎng)前期含量變化幅度小于野生型擬南芥，整體丙二醛含量也較低；在干旱處理過(guò)程中，野生型擬南芥蓮座葉中丙二醛含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升且速率較穩(wěn)定，rcpld-oe植株的丙二醛含量在干旱處理中也有所提升，但提升幅度始終低于野生型擬南芥(圖3，E)。在總?cè)~綠素含量方面，rcpld-oe植株在正常澆水條件下與野生型擬南芥表現(xiàn)有所不同，其蓮座葉總?cè)~綠素積累的速度較慢；在干旱處理過(guò)程中，野生型擬南芥中總?cè)~綠素含量的積累受到了顯著的抑制，rcpld-oe植株中的總?cè)~綠素含量也有所降低，但受抑制程度顯著低于野生型擬南芥(圖3，F(xiàn))。以上結(jié)果說(shuō)明明RcPLD的過(guò)量表達(dá)使擬南芥在干旱過(guò)程中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著提高，進(jìn)而使水分的損失程度降低，同時(shí)通過(guò)降低膜損傷程度和光合作用抑制水平來(lái)對(duì)植株進(jìn)行保護(hù)。

圖3 干旱處理過(guò)程中野生型和rcpld-oe擬南芥植株蓮座葉相關(guān)指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of related index in rosette leaf of wild-type and rcpld-oe Arabidopsis thaliana under the drought treatment

3 討 論

在不同植物中，不同的PLD基因被證實(shí)能夠影響植物的脅迫耐受能力。擬南芥中PLDα缺陷突變體的葉片蒸騰失水率顯著高于野生型，pldα1-1在干旱脅迫下表現(xiàn)出比野生型更高的敏感性[24-25]；菊花(Chrysanthemummorifolium)CmPLDα基因參與菊花的多種脅迫過(guò)程，包括機(jī)械損傷、高溫脅迫、缺磷脅迫以及鹽脅迫[26]；而在苔蘚植物中PLD的抗逆功能還缺乏報(bào)道。本研究構(gòu)建的不同RcPLD過(guò)表達(dá)擬南芥株系rcpld-oe具有不同的RcPLD表達(dá)量，但在正常生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)的特征基本一致，基本表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)階段下植株體積明顯小于野生型擬南芥，蓮座葉較小，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期較長(zhǎng)，抽薹期延后等。

在干旱處理?xiàng)l件下，本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥不同rcpld-oe株系植株總體抗旱能力明顯強(qiáng)于野生型擬南芥，3周齡的rcpld-oe幼苗在自然干旱處理28 d后基本能夠存活，多數(shù)植株在復(fù)水后能夠恢復(fù)生長(zhǎng)，而野生型擬南芥無(wú)法恢復(fù)。與正常生長(zhǎng)的植株相比，野生型擬南芥植株體積在干旱脅迫過(guò)程中明顯下降，而rcpld-oe植株在形態(tài)上受干旱脅迫抑制程度較小，甚至在干旱處理初期植株體積還略大于野生型擬南芥。值得注意的是，RcPLD賦予擬南芥抗旱性的情況并不完全與RcPLD的表達(dá)量呈正相關(guān)，在進(jìn)行干旱處理的3個(gè)rcpld-oe株系中，rcpld-oe-3-3中RcPLD的表達(dá)量最高，但在3個(gè)株系中的抗旱能力表現(xiàn)為最弱，我們推測(cè)RcPLD對(duì)擬南芥抗旱能力的提升需要一個(gè)最適區(qū)間，也可能存在RcPLD在擬南芥基因組插入位點(diǎn)的影響，但3個(gè)rcpld-oe株系在表型特征上的一致性顯示rcpld-oe-3-3在抗旱性方面的表現(xiàn)更可能與表達(dá)量相關(guān)，這個(gè)推論將在后續(xù)的工作中進(jìn)一步進(jìn)行分析驗(yàn)證。

本研究對(duì)野生型和rcpld-oe株系擬南芥干旱處理前21 d的材料進(jìn)行了部分生理生化指標(biāo)的測(cè)定，以初步分析RcPLD在提高擬南芥抗旱功能中可能的作用。首先，在水分保持能力方面，正常生長(zhǎng)條件下野生型和rcpld-oe株系蓮座葉相對(duì)含水量水平相似，都能夠維持在90%以上，相對(duì)而言rcpld-oe株系相對(duì)含水量在生長(zhǎng)過(guò)程中變化更平穩(wěn)；在干旱處理過(guò)程中，野生型植株相對(duì)含水量下降的程度顯著高于rcpld-oe植株，在干旱處理21 d時(shí)已接近70%，而除rcpld-oe-1-13和rcpld-oe-2-9植株的相對(duì)含水量都能夠維持在80%以上，說(shuō)明RcPLD的過(guò)量表達(dá)可能增強(qiáng)了擬南芥在干旱條件下防止水分散失的能力。曾有研究表明PLD的活性增加能夠促進(jìn)脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程來(lái)降低植物在干旱脅迫下的水分散失[27]，我們認(rèn)為這可能是RcPLD在過(guò)表達(dá)植株中提升抗旱性的機(jī)制之一。同時(shí)，氣孔關(guān)閉程度提升會(huì)導(dǎo)致CO2攝入量減少，進(jìn)而影響有機(jī)物同化量而導(dǎo)致植物體生長(zhǎng)速率的減慢[28]，這也與我們觀察到的形態(tài)特征表現(xiàn)相一致，但RcPLD更精確的抗旱功能機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

其次，在干旱脅迫條件下，細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量對(duì)于植物水分調(diào)節(jié)能力十分重要，隨著干旱脅迫程度的加深，植物細(xì)胞往往要增加細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)應(yīng)對(duì)外界提升的滲透勢(shì)，游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)是常在植物遭受滲透脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)物質(zhì)[23]。本研究對(duì)野生型和rcpld-oe擬南芥植株在干旱處理過(guò)程中這3類物質(zhì)的含量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)野生型植株和rcpld-oe植株在可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量變化方面相差不大，雖然在干旱處理過(guò)程中存在顯著差異，但在差異幅度方面較小，而rcpld-oe植株在干旱處理過(guò)程中脯氨酸含量增加的速度和積累量都明顯優(yōu)于野生型植株，這說(shuō)明過(guò)量表達(dá)的RcPLD在擬南芥的抗旱過(guò)程中可能參與了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)控，但對(duì)可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)總量的影響程度較低，可能主要參與了增加游離脯氨酸累積的過(guò)程。

再次，丙二醛作為膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物常被用于指示細(xì)胞膜完整性的代謝產(chǎn)物，通常認(rèn)為丙二醛含量越低，膜脂過(guò)氧化程度越低，膜完整性越高[23]。從本研究結(jié)果可知，正常生長(zhǎng)條件下野生型擬南芥蓮座葉片丙二醛含量的增加幅度就明顯高于rcpld-oe植株，這可能是由于野生型擬南芥與rcpld-oe植株相比蓮座葉片本身衰老的速度就較快有關(guān)；在干旱處理過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥葉中丙二醛含量提升的速度和幅度顯著增強(qiáng)，而rcpld-oe植株葉中丙二醛含量增加的幅度顯著小于野生型植株，這說(shuō)明在干旱處理過(guò)程中RcPLD一定程度上降低了rcpld-oe植株葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)的過(guò)氧化傷害。

另外，在不同植物應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫的過(guò)程中，光合作用采取的機(jī)制不盡相同，本研究檢測(cè)了干旱處理過(guò)程中擬南芥野生型和rcpld-oe植株蓮座葉總?cè)~綠素的含量，探索RcPLD在提升擬南芥抗旱能力的過(guò)程中對(duì)光合作用可能產(chǎn)生的影響。研究發(fā)現(xiàn)在正常生長(zhǎng)條件下，rcpld-oe植株總?cè)~綠素的累積速度比野生型植株慢，這可能與rcpld-oe植株蓮座葉生長(zhǎng)較慢的現(xiàn)象有關(guān)；與正常生長(zhǎng)條件下相比，干旱處理過(guò)程中野生型和rcpld-oe植株總?cè)~綠素的含量都有所減少，但相對(duì)而言野生型植株中葉綠素含量的減少程度更大。

綜上所述，本研究對(duì)前期發(fā)現(xiàn)響應(yīng)砂蘚脫水脅迫的磷脂酶D編碼基因RcPLD在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)的作用進(jìn)行了初步探討，利用已克隆的RcPLD編碼序列構(gòu)建了植物中的過(guò)量表達(dá)載體，構(gòu)建了RcPLD的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系rcpld-oe，并獲得了多個(gè)T3代rcpld-oe純合體株系。這些擬南芥rcpld-oe植株的抗旱能力整體上強(qiáng)于野生型擬南芥植株，在正常生長(zhǎng)條件下與野生型擬南芥植株相比在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段體積較小，但營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，抽薹較晚，蓮座葉衰老速率較慢。同時(shí)，過(guò)量表達(dá)的RcPLD使擬南芥在干旱脅迫條件下的水分散失速率降低，在一定程度上降低了干旱脅迫的膜損傷和光合作用抑制程度，但對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化影響較小。因此，本研究認(rèn)為砂蘚中的RcPLD可以用于提高植物的抗旱性，其更深入的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。