孫遠(yuǎn)東 王 杰

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 安徽蚌埠 233000)

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是突變磁場與物質(zhì)相互作用的一種物理現(xiàn)象，是目前化學(xué)領(lǐng)域用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定和研究的重要工具。核磁共振技術(shù)可分為核磁共振成像和核磁共振波譜。核磁共振成像現(xiàn)今主要運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在檢測疾病時不會對患者產(chǎn)生任何損傷，有別于傳統(tǒng)的檢測手段[1]；核磁共振波譜主要用于有機(jī)化合物及藥物的結(jié)構(gòu)研究，核磁共振波譜分為核磁共振氫譜(1H-NMR)和核磁共振碳譜(13C-NMR)。其中1H-NMR可顯示有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中氫原子所處的化學(xué)環(huán)境、空間及數(shù)目等信息，可確定分子結(jié)構(gòu)。13C-NMR可顯示有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中碳原子所處的化學(xué)環(huán)境及數(shù)目等信息，對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步佐證[2-3]。目前核磁共振波譜在藥物研發(fā)、高分子材料等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。核磁共振技術(shù)的使用不僅讓學(xué)生提高了對該尖端儀器的熟悉度，也培養(yǎng)了其探索的興趣，具有非常重要的實踐和教育意義。

美沙拉嗪又名馬沙拉嗪，化學(xué)名為5-氨基-3-羥基苯甲酸，結(jié)構(gòu)如圖1所示。其是治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分，對腸壁的炎癥有明顯的抑制作用[4]。藥理學(xué)研究顯示，美沙拉嗪用于結(jié)腸炎的治療主要是通過抑制前列腺素的合成和炎性介質(zhì)白三烯的形成，從而對腸黏膜的炎癥起到明顯的抑制作用。目前面世的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中，美沙拉嗪具有不良反應(yīng)少，毒性低和耐受性強(qiáng)等特點，具有非常好的應(yīng)用前景[5-6]。為了與現(xiàn)實社會相關(guān)聯(lián)，避免出現(xiàn)教學(xué)與社會實際的脫節(jié)，該校在設(shè)置專業(yè)綜合實驗時選擇了美沙拉嗪的合成。綜合實驗的模式不再是傳統(tǒng)式的灌輸、全憑老師指導(dǎo)，其更加注重鍛煉學(xué)生自主分析解決問題的能力，可以有效避免學(xué)生對教師和教材的依賴；同時在實驗中核磁共振技術(shù)，不僅對所做實驗結(jié)果進(jìn)行驗證，也激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生對所學(xué)藥物合成、藥物設(shè)計、色譜、波譜解析等學(xué)科知識的連貫性、系統(tǒng)性，以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識和科研素養(yǎng)；顯著提高了制藥工程專業(yè)綜合實驗的教學(xué)效果。

圖1 美沙拉嗪結(jié)構(gòu)

1實驗項目確定

蚌埠醫(yī)學(xué)院制藥工程實驗項目繁多，但多數(shù)為驗證性實驗或單元操作，此類實驗可加深學(xué)生對所學(xué)理論知識的理解，有利于對課本理論知識的運(yùn)用和夯實。近年來，制藥行業(yè)飛速發(fā)展，對專業(yè)人才同時具有動手能力、設(shè)計能力、思考解決問題的能力等綜合素質(zhì)要求越來越高，僅開展驗證性實驗等已無法滿足企業(yè)對人才的高要求。因此，在原有驗證性實驗、藥物合成實驗等單元操作的基礎(chǔ)上，該校為制藥工程專業(yè)開設(shè)了制藥工程綜合實驗。為了讓學(xué)生了解制藥行業(yè)動態(tài)，通過走訪眾多藥物生產(chǎn)企業(yè)，確立了將美沙拉嗪的合成作為綜合實驗內(nèi)容。為了提高學(xué)生對現(xiàn)代檢測手段和實驗技術(shù)的運(yùn)用能力，在美沙拉嗪的合成實驗中引入核磁共振技術(shù)。

2實驗任務(wù)分配

綜合實驗強(qiáng)調(diào)以學(xué)生為中心，采取根據(jù)學(xué)生的學(xué)號先后，將學(xué)生按5人一組進(jìn)行分組，指導(dǎo)老師指導(dǎo)學(xué)生如何從各大數(shù)據(jù)庫查閱文獻(xiàn)。學(xué)生通過自主查閱文獻(xiàn)，并進(jìn)行總結(jié)與篩選，結(jié)合所學(xué)知識設(shè)計出一條具有可操作性、合理且安全的美沙拉嗪的合成路線。路線設(shè)計出后先交由指導(dǎo)老師審批通過后，由學(xué)校合成方面的研究生進(jìn)行安全培訓(xùn)和操作培訓(xùn)后才可開展實驗。

3實驗結(jié)果及過程

3.1實驗過程

同學(xué)們通過文獻(xiàn)的檢索，設(shè)計了合成美沙拉嗪的合成路線，主要包括：①以水楊酸為原料，經(jīng)過硝化反應(yīng)生成5-硝基水楊酸，再在金屬催化劑的作用下發(fā)生還原反應(yīng)生成美沙拉嗪[7]；②以苯胺為原料，經(jīng)重氮化反應(yīng)生成氯化重氮苯，該化合物與水楊酸發(fā)生偶合反應(yīng)生成苯偶氮水楊酸，再在堿性條件下與連二亞硫酸鈉發(fā)生還原反應(yīng)最終生成美沙拉嗪[8]；③以對乙酰氨基苯酚為原料，在固體催化劑的作用下，與CO2發(fā)生Kolbe-Schmitt 反應(yīng)，再經(jīng)酸化得到美沙拉嗪[9]；④以5-硝基鄰氯苯甲酸為原料，在氫氧化鉀體系下發(fā)生水解反應(yīng)，還原反應(yīng)得到美沙拉嗪[10]。每組學(xué)生根據(jù)設(shè)計的合成路線，并采用核磁共振氫譜進(jìn)行結(jié)果確證，均得到目前化合物。各合成路線的具體操作步驟如下：

(1)水楊酸硝化還原。操作步驟：取5g水楊酸，加入一個100mL配有回流冷凝裝置的三口燒瓶中，加入50mL純凈水、20mL醋酸和10mL丙酮，升溫至55℃，緩慢滴加10mL的68%硝酸與醋酸的混合酸(體積比10∶1)，加畢升溫至65～75℃保溫2h。反應(yīng)完全后將溶液倒入60mL純凈水中，降溫在0～5℃繼續(xù)析晶2h，過濾，重結(jié)晶，干燥得到5-硝基水楊酸，收率61.2～74.8%。取一個100mL配有回流冷凝裝置的三口燒瓶，加入3mL濃鹽酸和50mL純凈水，升溫至60℃后一次性加入2g鐵粉，升溫至回流，再加入1.5g 5-硝基水楊酸，加畢繼續(xù)攪拌10min，再分3批加入4.5g 5-硝基水楊酸和6g鐵粉，加畢繼續(xù)回流反應(yīng)1.5～2h。反應(yīng)完全后熱溶液條件下用50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=11～12，趁熱抽濾，濾液用40%的硫酸溶液調(diào)節(jié)pH=3，冷卻析晶，過濾，干燥得到美沙拉嗪粗品；將粗品加入80mL純凈水中，加熱溶清后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=1，加入活性炭2g，加入回流5min，趁熱抽濾，濾液滴加氨水調(diào)節(jié)pH=3，調(diào)畢冷卻至0～5℃保溫1h后抽濾，濾餅用適量冰水洗滌，干燥得到粉紅色癥狀晶體，收率79.2～89.5%。具體合成路線如圖2所示。

圖2 水楊酸硝化還原法反應(yīng)合成美沙拉嗪

(2)苯偶氮水楊酸還原法。操作步驟：100mL三口瓶中加入3.8g苯胺、9mL濃鹽酸和9mL水，置于冰機(jī)中冷卻至-2℃攪拌10min，緩慢滴加4.2mol/L的亞硝酸鈉溶液10mL，滴加溫度不得超過2℃，加畢繼續(xù)反應(yīng)攪拌30min，所得淡黃色溶液保存?zhèn)溆?；另取一個100mL三口瓶，加入5.6g水楊酸和20mL 5mol/L的氫氧化鈉溶液，攪拌至固體完全溶清，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至冰機(jī)中降溫至5℃，將上述反應(yīng)所得溶液緩慢加入其中，滴加溫度不得超過5℃，加畢繼續(xù)反應(yīng)1h，有紅棕色沉淀生成，抽濾，得到紅棕色固體濕品約13g，收率約81%；將紅棕色固體加入250mL三口瓶中，加入2.5mol/L氫氧化鈉溶液60mL，升溫至90℃，在此溫度下分四批加入22g連二亞硫酸鈉，加畢繼續(xù)反應(yīng)1h，趁熱抽濾，濾液冷卻分層，取水層攪拌下滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=3，有大量白色固體析出，抽濾，干燥得5.3g類白色固體，固體采用水進(jìn)行重結(jié)晶，干燥得到美沙拉嗪，收率60～70%。具體合成路線如圖3所示。

圖3 苯偶氮水楊酸還原法反應(yīng)合成美沙拉嗪

(3)Kolbe-Schmitt法。操作步驟：取5g對乙酰氨基酚、7.5g碳酸鉀和2.5g氧化硅，加入200mL高壓反應(yīng)器中，通入二氧化碳在170℃和1.5MPa下反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液降溫至80℃下加入500mL蒸餾水，活性炭進(jìn)行脫色，所得濾液用20%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=4，降至室溫過濾，得白色固體美沙拉嗪，收率85～97%。具體合成路線見圖4。

圖4 Kolbe-Schmitt法反應(yīng)合成美沙拉嗪

(4)鹵代芳烴水解還原法。操作步驟：取14g氫氧化鉀加入100mL配有回流冷凝裝置的三口瓶中，加入50mL水充分溶清后，保持在20～40℃內(nèi)緩慢加入10g 2-氯-5-硝基苯甲酸，升溫至120℃下保溫反應(yīng)6h，反應(yīng)完全后降至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=1～3，再攪拌1.5h，過濾，50mL水洗滌濾餅，濾餅用30mL水再25～30℃下打漿，過濾，干燥得到2-羥基-5-硝基苯甲酸，收率90～95%；另取一個100mL三口瓶，加入3.26g碳酸鈉，加入64mL水溶清后分批加入上述固體8g，使其pH位于8～10之間，將10%得Raney Ni溶液加入，于60℃，3MPa下氫化反應(yīng)6h，原料反應(yīng)完全后，反應(yīng)體系冷卻至室溫下，加入26mL5%氫氧化鈉水溶液，加畢繼續(xù)攪拌30min，過濾，濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=2.5～3.5，攪拌析晶，過濾得到粗品，粗品轉(zhuǎn)移至100mL三口瓶中，加入11.2mL水和8.2mL濃鹽酸，加熱至70℃，加入0.56g活性炭，保溫攪拌2h，趁熱抽濾，濾液用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH=3～4，降至室溫，攪拌1h析晶，抽濾，濾餅加入適量水洗滌，干燥得到白色結(jié)晶美沙拉嗪，收率80～85%。具體合成路線見圖5。

圖5 鹵代芳烴水解還原反應(yīng)合成美沙拉嗪

3.2 1H分析及結(jié)構(gòu)解析

為了鍛煉學(xué)生對現(xiàn)代檢測手段得能力和提高對所學(xué)波譜知識的掌握程度，在所設(shè)實驗中引入核磁共振氫譜，用于佐證目標(biāo)化合物為美沙拉嗪。美沙拉嗪的1H-NMR譜圖解析如下：以DMSO-d6為溶劑，δ=2.50為DMSO-d6溶劑吸收峰，δ7.21(d， J = 4 Hz， 1H)，δ6.92～6.89 (m， 1H)，δ6.71(d， J = 8 Hz， 1H)為苯環(huán)上的三個氫，δ5.21 (s， 2H)為氨基上的兩個氫，羥基和羧基上的氫均為顯示，氫譜顯示所合成化合物為美沙拉嗪。詳見圖6。

圖6 美沙拉嗪的1H- NMR譜圖

4結(jié)語

綜合實驗的開展不僅可以加深學(xué)生對理論知識的掌握，而且還培養(yǎng)了學(xué)生的動手能力和實驗水平。該專業(yè)開設(shè)的實驗項目主要以學(xué)生為中心，鍛煉了其自我設(shè)計，獨(dú)立從事科學(xué)研究的能力。項目開展過程中，將核磁共振技術(shù)引入到美沙拉嗪的實驗教學(xué)中，不僅能夠更加準(zhǔn)確的進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和確認(rèn)實驗結(jié)果，另外也讓學(xué)生了解和使用現(xiàn)代化的檢測手段，進(jìn)一步開闊其視野與提高科學(xué)素養(yǎng)，全面提高學(xué)生的總體素質(zhì)，為以后其在學(xué)習(xí)和工作奠定一個堅實的基礎(chǔ)。