覃一書,保欣晨,汪 潔,于 淼,田 穩(wěn),張夢研,向 萍 (西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/環(huán)境修復(fù)與健康研究院,云南昆明 650224)

近年來,環(huán)境污染帶來的食品安全問題廣受關(guān)注[1-2],重金屬超標(biāo)食品(如鎘大米等)潛在的健康風(fēng)險成為了研究熱點之一[3].我國鎘(Cd)污染以 7%的點位污染率居重金屬污染首位[4].Cd分布廣泛、毒性持久,其污染及危害已成為嚴(yán)重的環(huán)境醫(yī)學(xué)問題.食物的生產(chǎn)、運輸過程存在重金屬污染的風(fēng)險[5].大量研究發(fā)現(xiàn),重金屬污染區(qū)域食物(肉類[6]、水產(chǎn)品類[7-8]、谷物蔬菜類[9-10]等)中重金屬Cd含量普遍較高,可見人體攝入Cd的頻率不容忽視.

食物攝取是人體重金屬暴露的主要途徑之一.被污染的食物經(jīng)口攝入,通過胃腸道的消化吸收,經(jīng)過血液循環(huán),積聚在人體器官、組織內(nèi)會導(dǎo)致器官功能和代謝的異常,進(jìn)而對人體產(chǎn)生毒性效應(yīng).Cd的攝入不僅會對肝、腎、胃等器官造成危害,也會對腸道造成影響[11].腸道菌群是腸道屏障的重要組成部分,也可能是環(huán)境污染物生物有效性和毒性的重要中介,它們以不同的吸收方式與腸道內(nèi)的金屬相互作用.不被吸收的Cd殘留物不僅會影響腸道菌群結(jié)構(gòu),還會影響腸道屏障功能,進(jìn)而影響機體功能[12].已有研究表明,低劑量Cd暴露會導(dǎo)致小鼠腸道菌群改變,增加腸道的通透性來影響肝臟基因的表達(dá),造成雄性小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪堆積[13-14].此外,重金屬暴露時間長短會對腸道菌群變化產(chǎn)生顯著差異[15].

腸道菌群可通過多種方式(吸收、代謝、隔離和排泄)對重金屬進(jìn)行解毒,其中飲食是此過程的主要因素.不同飲食因其不同的營養(yǎng)結(jié)構(gòu),會對腸道微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大差異性.有研究表明,高脂飲食影響腸道菌群導(dǎo)致肥胖發(fā)生的機制是通過降低厚壁菌門比例,提高擬桿菌門比例,從而降低對胰島素和瘦素等的敏感度[16-17].肥胖也可以反過來影響腸道菌群的組成,進(jìn)一步加劇肥胖,甚至導(dǎo)致其他疾病的發(fā)生.

隨著人們生活水平的提高,高脂食物攝入量顯著增加[18].因此,Cd和高脂一起進(jìn)入人體消化系統(tǒng)的概率成為高頻事件,其健康危害研究十分迫切.此外,Cd或者高脂均可誘發(fā)肥胖[19-20].然而,高脂食物和Cd污染食物一起被人體攝入后會對腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生什么樣的影響,它與正常飲食Cd暴露之間又存在哪些差異仍然未知.本研究通過探究高脂飲食和正常飲食下Cd攝入對腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異,為人們健康飲食和有效防控提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設(shè)計

正常飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)、高脂飼料(TP23101,脂含量45%)及對照飼料(TP23103,脂含量10%)(南通特洛菲飼料科技有限公司)、CdCl2·2.5H2O(AR)[21-22],玉米芯墊料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司).

將7周齡雄性C57BL/6小鼠(購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司)置于控制溫度和光照的房間里((23±2)℃,12h光照-暗交替),經(jīng)過 1周的馴化,隨機分成4組,每組4只(表1).試驗期間,每3d更換飼料、飲水及墊料等,并及時進(jìn)行鼠籠的清潔.喂食20周后,稱取各小鼠體重,并收集各組實驗小鼠的糞便樣品,進(jìn)行16S rRNA高通量測序.

表1 各處理組的飲食情況Table 1 Diet of each treatment group

1.2 16S rRNA高通量測序及生物信息處理

對小鼠糞便進(jìn)行總DNA提取,利用瓊脂糖凝膠電泳對總DNA進(jìn)行定性檢測后,進(jìn)行濃度和純度的測定.選擇 16S V3-V4可變區(qū),使用引物 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/806R(5′-GGA-CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行 PCR 擴增;得到的擴增產(chǎn)物經(jīng) 2%的瓊脂糖凝膠檢測,切膠回收,進(jìn)行定量分析.構(gòu)建MiSeq文庫,利用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序.本研究測序工作交由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成.

測序得到的原始數(shù)據(jù)存在干擾項,在進(jìn)行拼接、過濾后,進(jìn)行 OUTs聚類[23]和物種分類的分析,序列相似度達(dá) 97%則為一個 OUT.將 OTUs與物種注釋相結(jié)合,以便于后續(xù)基于OTUs聚類進(jìn)行物種豐度、多樣性分析以及各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用 Excel、R語言等軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(One-way ANOVA, Mean±SEM),若 P＜0.05,則有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飲食習(xí)慣下Cd攝入對小鼠體重的影響

體重作為小鼠生長發(fā)育的一種基本生理指標(biāo),可直觀地表現(xiàn)出不同的處理方式對小鼠產(chǎn)生的影響.如圖1所示,對雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行長達(dá)20周的不同飲食飼養(yǎng)以及 10mg/L CdCl2溶液暴露后,發(fā)現(xiàn)與飼喂正常飼料(ND、ND+Cd)的小鼠相比,高脂飼料(HFD、HFD+Cd)的攝入使小鼠體重明顯增加,表現(xiàn)出肥胖;而無論是在正常飲食,還是高脂飲食下,Cd攝入(ND+Cd、HFD+Cd)對小鼠體重的增長均無明顯作用.

圖1 不同處理后小鼠體重的變化Fig.1 Weight changes of mice after different treatments

2.2 不同飲食習(xí)慣下Cd攝入對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 OTUs聚類分析 4組樣品共獲得有效序列736522條,其中 ND組樣品包含 169146條,ND+Cd組樣品包含 214270條,HFD組樣品包含 201706條,HFD+Cd組樣品包含192022條;分屬10門,18綱,27目,50科,87屬.

通過分類操作單元(OTUs)韋恩圖(圖 2),研究不同處理組間 OTU組成的相似性和重疊性.全部樣品總共獲得為6620個OTU,4組(ND、ND+Cd、HFD、HFD+Cd)樣品的OTU總數(shù)分別為2128、2388、3282、3107,獨有的OTU數(shù)分別為607、772、1408和1346;兩兩處理組(ND/ND+Cd、ND+Cd/HFD、HFD/HFD+Cd、HFD+Cd/ND)之間共有的OTU數(shù)分別為986、1163、1305、1013與ND組OTU數(shù)相比,ND+Cd、HFD和HFD+Cd組的OTU數(shù)分別增長了12.22%、54.23%、46.01%.數(shù)據(jù)表明,高脂飲食或/和Cd攝入均可提高小鼠腸道的微生物多樣性.高脂飲食下攝入Cd降低了高脂飲食下的微生物多樣性.

圖2 韋恩圖Fig.2 Venn diagram

2.2.2 腸道微生物 Alpha多樣性分析 微生物群落物種多樣性的常用評價指標(biāo)是多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù).本研究采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評價小鼠腸道菌群的多樣性;微生物菌群豐富度則由Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)來表示.Alpha多樣性分析見表 2,各組中的 Coverge都在 0.977以上,說明數(shù)據(jù)代表了樣品中 97.7%以上的細(xì)菌類型,測序的深度、廣度都符合要求.ND+Cd、HFD、HFD+Cd組的 ACE、Chao1和Shannon指數(shù)均比ND 組高(P＞0.05), Simpson指數(shù)比 ND 組低(P＞0.05).表明,高脂飲食或/和Cd攝入在一定程度上提高了小鼠腸道菌群多樣性(P＞0.05),高脂飲食下攝入Cd,腸道菌群無明顯變化(P＞0.05).此結(jié)果與上述OTUs聚類分析基本吻合.

表2 不同處理后腸道菌群的Alpha多樣性變化Table 2 Changes of Alpha diversity of gut microbiota after different treatments

2.2.3 基于Unifrac的主坐標(biāo)分析(PCoA) PCA分析(圖3 (a))可以直觀地看出不同組之間并未出現(xiàn)明顯的分離.本文采用加權(quán) Unifrac距離來分析微生物群落.PC1和PC2是兩個主坐標(biāo)成分,PC1表示盡可能最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標(biāo)成分,PC2為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標(biāo)成分,以此類推.PCoA圖中,樣品距離越近,物種組成結(jié)構(gòu)就越相似.因而,群落結(jié)構(gòu)越相似,樣品聚集程度越高;相反,樣品離散程度越大,則表示群落差異越大.如圖3(b)所示,PC1貢獻(xiàn)率為43.50%,PC2貢獻(xiàn)率為16.64%,總貢獻(xiàn)率為60.14%.第一主軸使得 ND組和 HFD、HFD+Cd組相互分離(P＜0.05);第二主軸分離了HFD+Cd組和ND、ND+Cd組,且HFD+Cd組和ND+Cd組存在顯著差異(P＜0.05).根據(jù)腸道微生物組的個體差異,ND組、HFD組被分為了2個亞組; HFD+Cd組樣品基本集中在1個區(qū)域,結(jié)構(gòu)分布較為緊湊,相似度較高;ND+Cd組離散程度較高,組內(nèi)差距較大.表明,高脂飼料或/和Cd攝入都會干擾小鼠腸道菌群原有的結(jié)構(gòu).

圖3 不同處理后腸道菌群的Beta多樣性分析Fig.3 The Beta diversity of the gut microbiota after different treatments

2.2.4 Lefse分析 Lefse分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識的分析工具,可以實現(xiàn)多個分組之間的比較,強調(diào)統(tǒng)計意義和生物相關(guān)性,能夠在組間找到在豐度上有顯著差異的物種.結(jié)果顯示(圖4),群落結(jié)構(gòu)在各分類水平都發(fā)生了變化,共1個門、3個綱、4個目、6個科和10個屬上的物種在各處理組中存在著顯著差異.ND組差異物種富集于擬桿菌(Bacteroidia、Bacteroidales、Bacteroidales_S24_7_group);ND+Cd組中疣微菌(Verrucomicrobiae、Verrucomicrobiales、Verrucomicrobiaceae)、阿克曼菌(Akkermansia)和 Erysipelatoclostridium存在差異;HFD組中的差異物種集中在了丹毒絲菌(Erysipelotrichia、Erysipelotrichales、Erysipelotrichaceae);而 HFD+Cd組中毛螺旋菌(Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group)、梭菌(Clostridia、Clostridiales)、 理 研 菌 (Rikenellaceae、Rikenellaceae_RC9_gut_group)、瘤胃球菌(Ruminococcaceae、Ruminococcaceae_UCG_014)、另枝菌(Alistipes)、鏈球菌(Streptococcus)、糞球菌(Coprococcus_3)、羅斯氏菌(Roseburia)和凸腹真桿菌([Eubacterium]_ventriosum_group)與其他組存在顯著差異,它們絕大多數(shù)歸屬于厚壁菌門.

圖4 不同處理后的Lefes分析Fig.4 LDA Effect Size analysis after different treatments

2.2.5 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化 (1)門水平小鼠 腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化 在門分類水平上共獲得10個門.如圖5 (a)所示,在各處理組共有的小鼠腸道菌群中處于前 5位的菌群分別是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形桿菌門(Proteobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes),其中擬桿菌門和厚壁菌門均為各處理組的優(yōu)勢菌群.然而,擬桿菌門和厚壁桿菌門的數(shù)量在各組中是有差異的.

圖5 不同處理后的門水平物種分布Fig.5 Species distribution in different treatments on phylum .level

通過圖 5(b)發(fā)現(xiàn),在 ND 組中,擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度之和約為所有樣本細(xì)菌總數(shù)的(92.82±4.19)%.與正常飲食相比,高脂飲食小鼠的腸道內(nèi)擬桿菌門[HFD 組(34.69± 10.23)%、ND 組(79.14±4.57)%]豐度下降了 2.28 倍(P＜0.05),放線桿菌門[HFD 組(37.13±5.68)%、ND 組(3.60±3.78)%]豐度增加了 10.31倍(P＜0.05),厚壁菌門豐度也有一定水平的上升(P＞0.05).在不同飲食下攝入 Cd,腸道菌群結(jié)構(gòu)會表現(xiàn)出不一樣的反應(yīng).正常飲食下Cd攝入使擬桿菌門[ND+Cd組(48.66± 16.89)%,ND 組(79.14±4.57)%]的豐度有所下降(P＞0.05);高脂飲食下攝入 Cd使放線菌門[HFD+Cd組(8.13+2.60)%,HFD 組(37.13±5.68)%]的豐度降低了4.57倍(P＜0.05).值得一提的是,與ND組相比,在飲食不同的情況下(ND+Cd、HFD+Cd)攝入Cd并不影響厚壁菌門水平;但是 HFD+Cd組[(31.86±7.56)%]相對于 ND+Cd組[(11.37±7.51)%],大大增加了厚壁菌門的豐度(P＜0.05).另外,ND+Cd組疣微菌門(Verrucomicrobia)數(shù)量顯著升高,其豐度約占總菌群的4.67%.

通常Firmicutes/Bacteroidetes (F/B)比值被認(rèn)為是腸道菌群整體狀態(tài)的重要參數(shù)[24].經(jīng)計算, ND、ND+Cd、HFD、HFD+Cd組的 F/B比值分別為:(0.18±0.09)、(0.23±0.15)、(1.00±0.40)、(1.36±0.32).ND、ND+Cd、HFD、HFD+Cd組腸道微生物對應(yīng)的小鼠糞便F/B比值逐漸升高,其中ND與HFD、HFD+Cd ,ND +Cd與HFD、HFD+Cd組之間存在顯著差異(P＜0.05).根據(jù)菌群的正負(fù)面作用,把前五的菌門分為“好菌”和“壞菌”兩大類.經(jīng)計算, ND、ND+Cd、HFD、HFD+Cd組小鼠糞便中的“好菌(擬桿菌和疣微菌)”和“壞菌(厚壁菌、放線菌、變形菌)”比例分別為(4.16±0.96)、(3.07±2.23)、(0.59±0.27)、(0.59±0.10),且 ND 組和 HFD、HFD+Cd組存在顯著差異(P＜0.05).高脂飲食和Cd單一/復(fù)合暴露均可改變小鼠原有的腸道菌群結(jié)構(gòu).

(2) 屬水平小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化 選取豐度大于 1%的菌群,按其在樣本中的豐度,在物種和樣本兩個層次上進(jìn)行聚類,形成熱圖(圖6).實驗結(jié)果表明,各處理組腸道菌群在屬上存在差異,且高表達(dá)的菌群不存在重疊,表明腸道菌群發(fā)生了紊亂.ND組小鼠糞便中含有大量的擬桿菌(Bacteroides)、擬普雷沃菌(Alloprevotella)、副擬桿菌(Parabacteroides),還有豐度小于1%的其他菌群.相對ND組,攝入高脂飲食后(HFD組),小鼠腸道菌群的組成發(fā)生了變化,擬桿菌、擬普雷沃菌、副擬桿菌的表達(dá)量下降,使得雙歧桿菌(Bifidobacterium)、桿菌(Turicibacter)、乳桿菌(Lactocacillus)大量表達(dá)成為了優(yōu)勢種;其中雙歧桿菌((36.56±5.63)%)的豐度大幅度上升,相當(dāng)于ND 組(2.55±3.40)%)的 14.34倍.與 ND 組相比,Cd的攝入(ND+Cd組)使擬桿菌、擬普雷沃菌、副擬桿菌減少,出現(xiàn)了更多的未培養(yǎng)的擬桿菌(uncultured Bacteroidales bacterium)、阿克曼氏菌(Akkermansia)、腸桿菌(Enterorhabdus)、螺桿菌(Hlicobacter).HFD+Cd組較之ND +Cd組降低了雙歧桿菌、桿菌、乳桿菌的豐度,瘤胃球菌 UCG-014(RuminococcaceaeUCG-014)、另枝菌屬(Alistipes)、毛螺菌 NK4A136group (LachnospiraceaeNK4A136 group)、布勞特氏菌(Blautia)、脫硫弧菌(Desulfovibrio)成為了優(yōu)勢種群.攝入 Cd后,正常飲食和高脂飲食中出現(xiàn)的菌群表達(dá)各不相同.副擬桿菌的表達(dá)在ND、ND+Cd、HFD+Cd、HFD組中逐漸降低.

圖6 不同處理后屬水平物種豐度聚類熱圖Fig.6 Cluster thermal images of species abundence at the genus level of the microbial community after different treatments

3 討論

3.1 高脂飲食導(dǎo)致肥胖,影響腸道菌群組成

生活水平的提高使人們的飲食水平發(fā)生了巨大的變化,飲食健康問題逐漸成為社會焦點.高脂食物大頻率地出現(xiàn)在人們的生活中,而高脂飲食的攝取能夠?qū)е路逝值陌l(fā)生.肥胖增加肝病、糖尿病、腸炎等疾病的患病風(fēng)險,已被世界衛(wèi)生組織定義為慢性病[25-26].在本文研究中,高脂飲食促進(jìn)了小鼠體重的增長,并較正常飲食組存在明顯差異(圖1).高脂飲食導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可能與肥胖相關(guān)[27].腸道微生物維持機體功能的正常,其穩(wěn)態(tài)的破壞,可能會導(dǎo)致宿主腸道功能的喪失,引發(fā)各種疾病[28-30].Ley等[31]首先報導(dǎo)了肥胖與腸道微生物存在關(guān)系,同窩生的肥胖小鼠相較于瘦小鼠有著更少的擬桿菌門和更多的厚壁菌門[27].

人體第一次接觸到復(fù)雜的微生物群始于出生時通過產(chǎn)道[32].腸道菌群并不是一成不變的,它會因人、物、境的不同會發(fā)生相應(yīng)的改變.腸道的影響因素有很多,其中飲食被認(rèn)為是影響腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)最重要的決定因素.越來越多的研究表明,飲食的成分直接影響到腸道菌群的組成[33-34].高脂飲食作為一種典型的生物體腸道破壞性因素,會破壞腸道環(huán)境,降低腸道微生物群落多樣性[35].而在本文研究中,高脂飲食的攝入?yún)s增加了小鼠糞便內(nèi)的 OTU數(shù), alpha多樣性也有一定程度的提高(P＞0.05).實驗結(jié)果的不同可能源于研究方法上的差異和個體間的差異.正常的腸道微生物在門水平上,豐度最高的是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形桿菌門(Proteobacteria),其約 90%的腸道菌群由厚壁菌門和擬桿菌門組成[36-37].在本文研究中,ND組的四大優(yōu)勢門為擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形桿菌門,且擬桿菌門和厚壁菌門約占總菌群的92.82%(圖5a),與前人研究基本一致.有研究者認(rèn)為,腸道紊亂與腸道微生物的 F/B比值有關(guān).擬桿菌門的數(shù)目會隨著飲食的改變(低糖、低脂向高糖、高脂飲食轉(zhuǎn)變)而急速下降.高脂的攝入和肥胖都會導(dǎo)致腸道內(nèi)F/B比值明顯提高[31,38-43].與之相似,在本文中,ND 組小鼠的腸道微生物差異物種富集于擬桿菌;長期攝入高脂飼料后,小鼠的腸道微生物差異物種發(fā)生了改變,富集在了厚壁菌門的丹毒絲菌上(圖4).高脂食物的攝取,導(dǎo)致了擬桿菌門(P＜0.05)的下降和厚壁菌門(P＞0.05)、放線菌門(P＜0.05)的增加,使得 F/B 值顯著升高(圖 5b).也有人認(rèn)為,F/B 比值與胖瘦無關(guān),甚至可能是相反的.Hekmatdoost等發(fā)現(xiàn),高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠糞便中擁有著更多的擬桿菌數(shù)目,益生菌數(shù)目會減少[44].這些矛盾的結(jié)果使得 F/B比值與肥胖的關(guān)系尚無定論. 趙立平團隊認(rèn)為,要深入挖掘腸道微生物與肥胖的機制,不能忽略菌株水平的差異[45].厚壁菌門中也存不少的有益菌,如乳酸菌,這或許就是 F/B比值尚無定論的原因.近年來的研究表明,除了擬桿菌門和厚壁菌門以外,諸如,放線菌門(負(fù)面菌群)、變形菌門(負(fù)面菌群)、疣微菌門(正面菌群)等也與肥胖的發(fā)生有著重要作用.在本文中,ND組的 “好菌”/“壞菌”比例是(4.16±0.96),HFD組的“好菌”/“壞菌”比例僅為(0.59±0.27),高脂的攝入使腸道內(nèi)有害菌大量增長(P＜0.05).ND組內(nèi)的擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、副擬桿菌屬數(shù)目較多;攝入高脂食物后,這三個屬的豐度均大幅度下降了(圖 6).高脂食物的攝入會導(dǎo)致乳酸菌和雙歧桿菌的降低,其與肝臟脂肪的積累成密切負(fù)相關(guān)[46].但在本文中,這兩種菌屬的豐度在高脂飲食下反而增加了;尤其是放線菌門下的雙歧桿菌,其表達(dá)量更是達(dá)到了ND組雙歧桿菌10倍以上.值得注意的是,放線菌的增多容易引起內(nèi)源性感染.細(xì)菌多樣性低和乳酸菌豐度減少與腸道炎癥的發(fā)生有關(guān),被認(rèn)為是結(jié)腸癌的誘因.有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在炎癥小鼠體內(nèi)添加雙歧桿菌使其在體內(nèi)高表達(dá),能夠抑制炎癥細(xì)胞 NF-κB的激活,有效抑制腸道炎癥細(xì)胞因子的活化及腸粘膜反應(yīng),減輕腸道炎癥程度[47].高脂飲食小鼠腸道內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量的大量增長,有可能是其自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的結(jié)果,其機理尚需進(jìn)一步的研究.

3.2 Cd影響腸道菌群結(jié)構(gòu)

Cd是一種對環(huán)境有重大影響的有毒金屬.普通人體內(nèi)的 Cd主要來源于食物和水(除了吸煙以外).食物中的 Cd經(jīng)口攝入,在腸道內(nèi)被吸收或者積累.腸道內(nèi)的微生物是宿主不可或缺的組成部分,在宿主體內(nèi)維持腸道平衡以及對金屬等污染物的降解中扮演著一個中介的角色[48].腸道暴露于有毒重金屬可能對常駐菌群產(chǎn)生不同的影響.基于動物模型的研究使重金屬和腸道菌群之間的聯(lián)系有了長足的進(jìn)展[49-50].

重金屬暴露引起腸道微生物群的變化,但在各分類水平的研究上并無一致的結(jié)果.研究者們用 Cd暴露小鼠,均發(fā)現(xiàn)了腸道菌群的顯著改變,有研究發(fā)現(xiàn)Cd增加小鼠腸道內(nèi)擬桿菌門,降低厚壁菌門,也有研究表明Cd降低了小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度[51-53].Cd攝入使脂多糖增加,改變腸道微生物的代謝活性,并通過引起腸道炎癥和細(xì)胞損傷來增加腸道通透性[13].Breton等人發(fā)現(xiàn),Cd暴露會降低毛螺旋桿科的豐度,也會引起Clostridia、Clostridiales和短式脂肪酸(SCFA)產(chǎn)生菌豐度的降低,如Lachnospiraceae和Ruminoccaceae呈劑量依賴性降低[54].這與本文結(jié)果有所不同.在本研究中,Cd攝入改變了腸道微生物的組成,顯著降低擬桿菌門、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、副擬桿菌的豐度,使得以阿克曼氏菌屬為主的疣微菌門的數(shù)量大幅度增加,并出現(xiàn)了更多未培養(yǎng)的擬桿菌屬、腸桿菌屬和螺桿菌屬(圖6).與此相似的是,口服Ni、As或Cd等重金屬會顯著改變正常大鼠腸道微生物的組成,Cd使得腸道內(nèi)的疣微菌門數(shù)量大幅增加[50].Akk菌目前是Akkermansia菌屬的唯一菌種,阿克曼氏菌可降解黏蛋白,其豐度與超重、肥胖和高血壓等疾病呈負(fù)相關(guān)[55-58].事物普遍具有兩面性,Akk菌也不例外.另有研究證明,Akk 菌的增長似乎也與Ⅱ型糖尿病風(fēng)險正相關(guān);且在特定的條件下,Akk菌參與促進(jìn)代謝綜合征[59-60].Akkermansia菌的增長提示著 Cd暴露不會引起小鼠肥胖,這與小鼠的暴露后的體重變化(圖1)相吻合;但是否會引起其他方面的變化卻未可知,有待進(jìn)一步的研究.

3.3 高脂飲食Cd攝入造成腸道菌群紊亂

腸道菌群可能通過吸收、代謝、隔離和排泄的方式對重金屬進(jìn)行解毒,其中飲食是這個過程的主要因素.食物重金屬對宿主腸道的有害影響可能受到膳食成分的調(diào)節(jié).在Liu等[61]的研究中,Cd暴露下,高脂飲食對腸道菌群的影響比普通飲食更大,高脂飲食降低了小鼠腸道菌群的豐度(基于 OTU數(shù)量)和多樣性(基于 Chao1指數(shù)).本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食下攝入Cd,增加了腸道菌群豐度和微生物多樣性(圖2、表2).與ND+Cd組相比,HFD+Cd組具有更多的厚壁菌門,屬上的優(yōu)勢菌群發(fā)生了顯著的改變.HFD+Cd組相對于HFD組,顯著降低了放線菌門、雙歧桿菌屬的豐度,瘤胃菌屬、另枝菌屬、毛螺菌屬、布勞特氏菌、脫硫弧菌屬大幅度增加(圖 6).雙歧桿菌可抑制有害菌的生長繁殖,其豐度的降低會使得有害菌大量滋生.瘤胃球菌屬與腸易激綜合癥(IBS)相關(guān),且疼痛發(fā)作的頻率與另枝菌屬的豐度相關(guān),瘤胃球菌屬和另枝菌屬豐度的升高或許意味著IBS的發(fā)生[62].另外,布勞特氏菌屬在血脂調(diào)節(jié)和抗炎方面有著特殊的功效,其豐度的減少,可能會導(dǎo)致抗炎作用的喪失[63].HFD+Cd組小鼠體內(nèi)布勞特氏菌屬豐度的增高可能是機體應(yīng)對自身健康危害的調(diào)節(jié)方式.高脂食物聯(lián)合Cd暴露可能會增加患腸道疾病的風(fēng)險.

總的來說,高脂食物和Cd攝入均可改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu),但具體菌群的變化不具有一致性.動物種源、菌群起始差異、飼料成分、污染物的暴露形式(方式、劑量、時間)、樣本的收集處理,以及測序技術(shù)和分析方法等不同,都可能造成實驗結(jié)果的差異.本試驗采用的自由飲水暴露,相對于灌胃、注射等能更好地模擬正常的攝食方式,但是,自由飲水可能導(dǎo)致每個小鼠的攝水量不一樣,也就是攝入的重金屬含量產(chǎn)生了差異.這或許是導(dǎo)致了組間差異較大的原因之一.

經(jīng)口攝入被重金屬Cd污染的高脂食物,在腸道中首先被腸道菌群接觸.無論是Cd或高脂食物的攝入,亦或是高脂食物和Cd聯(lián)合攝入,都會直接或間接破壞小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)原有的平衡狀態(tài),造成腸道紊亂,使得“壞菌”的數(shù)量得到了增加.“壞菌”的增加會給生命體帶來了肥胖等疾病.反過來,肥胖的發(fā)生也會反過來加劇腸道菌群的失衡,進(jìn)而影響消化效率,造成一個惡性循環(huán).在重金屬污染頻繁出現(xiàn)的今天,研究飲食中重金屬對腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響對人體健康具有重大意義.腸道菌群的改變與人體疾病息息相關(guān),了解不同食物及重金屬的攝入對腸道菌群的影響,利于人們提升環(huán)境保護意識、食品安全意識,更為人們培養(yǎng)更加良好的飲食習(xí)慣,選擇更為健康舒適的生活方式提供幫助.

4 結(jié)論

4.1 高脂飲食促進(jìn)了小鼠的肥胖,提高了F/B比值,使“好菌”/“壞菌”的比例較ND組降低了7倍,并且使得放線菌門的豐度增長達(dá)10.31倍,雙歧桿菌的豐度增長達(dá)14.34倍.

4.2 10mg/L Cd暴露增加了以阿克曼氏菌屬為主的疣微菌門的數(shù)量,使疣微菌門細(xì)菌的豐度上升到了腸道總菌群的4.67%.

4.3 在高脂飲食的基礎(chǔ)上,10mg/L Cd攝入減少了4.57倍的放線菌門細(xì)菌的豐度,使得瘤胃菌屬、另枝菌屬、毛螺菌屬、布勞特氏菌、脫硫弧菌屬成為優(yōu)勢菌群.