路 通，劉菲菲，陳士強，劉光洲

（山東大學海洋研究院，山東 青島 266237）

0 引言

高鹽廢水一般指總含鹽質(zhì)量分數(shù)不低于1%的廢水[1]，其主要來源包括海水養(yǎng)殖廢水、海產(chǎn)品加工廢水、工業(yè)冷卻用水及某些石化產(chǎn)業(yè)廢水等[2]。伴隨著工業(yè)化經(jīng)濟的不斷發(fā)展，大量高鹽廢水的排放已給我國生態(tài)環(huán)境造成了嚴重威脅[3]。廢水處理是一個高成本、高能耗的行業(yè)，據(jù)統(tǒng)計，我國污水廠每年消耗的各類水處理藥劑高達10 萬t，水量電耗為0.33 kW·h/m3，約占全國電力總消耗的1%[4]?？梢姡瑢で笠环N低成本、低能耗的污水處理方式對推進我國資源節(jié)約型社會的建設(shè)具有重要意義。

人工濕地耦合微生物燃料電池（constructed wetland coupled microbial fuel cell,CW-MFC）作為一種集廢水處理和能源回收于一體的新型廢水處理技術(shù)，已越來越多地受到國內(nèi)外學者的關(guān)注[5-6]。TAO M N 等[7]構(gòu)建了以水葫蘆為濕地植物的CW-MFC 體系用于去除市政污水中氮和有機物，發(fā)現(xiàn)當C/N=5.37，HRT=48 h 時，CW-MFC 體系對NO3--N 的平均去除率達到84.9%，而CW 體系則僅為70%。相關(guān)研究表明，在生物電協(xié)助下CW-MFC 體系陰極區(qū)有利于自養(yǎng)反硝化菌富集[8]。此外XU L 等[9]通過構(gòu)建多生物陰極CW-MFC 體系進行脫氮時也發(fā)現(xiàn)，相比于單生物陰極的CW-MFC 體系，其反硝化速率由89.64±4.57 mg/（m2·d）提升至163.55±11.88 mg/（m2·d），且脫氮量與產(chǎn)電量呈現(xiàn)線性關(guān)系。

目前關(guān)于CW-MFC 體系在強化脫氮方面的研究主要集中在淡水領(lǐng)域，研究以模擬高鹽廢水為處理對象，考察了質(zhì)量分數(shù)分別為1%和3%2 種鹽度下CW-MFC 體系對廢水中污染物的去除效果，并通過高通量測序分析了各體系的微生物群落組成，揭示了CW-MFC 強化高鹽廢水中的脫氮機理，為拓寬其在廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。

1 實驗部分

1.1 實驗裝置

小型濕地反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意見圖1。

圖1 實驗裝置

圖1（a）為CW 體系，圖1（b）為CW-MFC 體系。2 種類型反應(yīng)器均由PE 管制成，內(nèi)徑為18 cm，高為70 cm，其中基質(zhì)層高度為60 cm。裝置底部鋪設(shè)5 cm 厚的卵石作為支撐層（A），下部和上部的基質(zhì)層（B）由石英砂和陶粒按質(zhì)量比1 ∶1 混合填充。中間陽極層（C）和表面陰極層（D）為5 cm 厚的石墨氈內(nèi)置鈦網(wǎng)，且陰極區(qū)中間部分剪去石墨氈并種植1株高度為50 cm 的木欖幼苗作為濕地植物（E）。CW-MFC 體系的陰、陽極用銅導線連接并外接1 000 Ω 的電阻（F），電阻兩端連接萬用電表（G）。人工配制的高鹽廢水由蠕動泵從底部連續(xù)泵入裝置，從裝置上層流出。

1.2 實驗設(shè)計

本研究共采用4 組濕地反應(yīng)器裝置，其中2 組為CW-MFC 體系，2 組為CW 體系，進水鹽度分別為1%，3%。裝置搭建完成后，取某污水處理廠厭氧池污泥3 L，按體積比1 ∶10 用海水稀釋并泵入裝置。連續(xù)循環(huán)運行1 周后引入人工合成的高鹽廢水。合成廢水配方見表1。不同鹽度廢水均用海鹽配制，各體系理論污染物質(zhì)量濃度分別為：ρ（COD）=300 mg/L，ρ（NH4+-N）=10 mg/L，ρ（NO3--N）=15 mg/L，ρ（TP）= 5 mg/L。進水采用連續(xù)流方式，水力停留時間（HRT）為3 d。待各CW-MFC 體系運行至出現(xiàn)穩(wěn)定的產(chǎn)電平臺后進行水質(zhì)測定。

表1 合成廢水配方 mg·L-1

1.3 分析方法

1.3.1 水質(zhì)測定

因模擬廢水具有較高的鹽度，故COD，NH4+-N，NO3－－N，NO2－－N，TP 等水質(zhì)指標按照GB 17378.4 —2007《海洋監(jiān)測規(guī)范第4 部分：海水分析》中的標準方法進行測定[10]。

1.3.2 輸出電壓

裝置啟動后，每日9：00 及21:00 使用萬用表對各CW-MFC 體系的外電阻進行電壓測定，取平均值作為當日該體系的輸出電壓。

1.3.3 微生物分析

完成水質(zhì)測定后，剪取各體系陰、陽極區(qū)域的石墨氈填料分別置于1 L 的無菌水中，超聲30 min。然后用濾徑為0.22 μm 的無菌濾紙抽濾并提取濾紙上的DNA。最后利用Illumina 平臺對樣品DNA 進行高通量測序，測序區(qū)域為標準細菌16S_V3V4 區(qū)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CW-MFC 的啟動與運行

在對CW-MFC 體系進行污泥接種后，微生物需經(jīng)歷附著、篩選、馴化和增殖等過程方能在電極表面形成穩(wěn)定的生物膜，進而出現(xiàn)穩(wěn)定的輸出電壓[11]，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，2 組CW-MFC 體系在25 d后電壓值趨于穩(wěn)定，表示裝置啟動成功。而在穩(wěn)定運行的60 d 內(nèi)，3%鹽度下的CW-MFC 體系輸出電壓較高，平均為509.77 mV，高于1%鹽度下的343.27 mV?？梢婝}度的增加提高了體系的輸出電壓，各CW-MFC 體系的陰極均能穩(wěn)定地從陽極獲得額外的電子供體。

圖2 CW-MFC 體系的輸出電壓

2.2 污染物去除效果

2.2.1 NO3--N 的去除效果

人工濕地對廢水中的NO3--N 的去除主要由微生物的反硝化作用將其轉(zhuǎn)化為N2而完成。若反硝化作用不徹底，則會產(chǎn)生較高的NO2--N 積累。本研究比較了2 種鹽度下CW-MFC 體系和CW 體系在60 d 內(nèi)對模擬高鹽廢水中NO3--N 的去除效果及NO2--N的積累情況，結(jié)果見圖3。

圖3 2 種鹽度下各體系中NO3--N 和NO2--N 的出水濃度

由圖3 可知，當NO3--N 的平均進水質(zhì)量濃度為15 mg/L 時，CW-MFC 體系和CW 體系均對其有較好的去除效果。1%鹽度下2 組體系中NO3--N 的平均出水質(zhì)量濃度分別為0.51，0.64 mg/L；3%鹽度下平均質(zhì)量濃度分別為0.43，0.93 mg/L，CW-MFC體系中NO3--N 的平均出水濃度低于CW 體系。此外在60 d 的運行周期內(nèi)，各體系出水中均出現(xiàn)了較高濃度的NO2--N 積累。1%鹽度下CW-MFC 體系和CW 體系中NO2--N 的平均出水質(zhì)量濃度分別為1.62，2.16 mg/L；3%鹽度下出水質(zhì)量濃度則分別為1.22，2.64 mg/L，CW-MFC 體系出水中的NO2--N 濃度明顯低于CW 體系?？梢?，相比于CW 體系，CWMFC 體系具有更好的反硝化性能。分析原因為傳統(tǒng)反硝化過程中反硝化菌需要大量的碳源作為電子供體，而相關(guān)研究表明在MFC 結(jié)構(gòu)中利用陰極電子作為直接電子供體可大幅降低反硝化過程對碳源的依賴[12]。

2.2.2 污染物去除效果

各類型濕地體系中NH4+-N，TIN，COD，TP 等污染物在60 d 內(nèi)的平均出水質(zhì)量濃度見表2。由表2可知，2 種鹽度下CW-MFC 體系中COD 的平均出水濃度均低于CW 體系，而TP 的平均出水濃度則略高于CW 體系。在NH4+-N 的去除方面，1%鹽度下2 種體系中的平均出水濃度相差不大，而3%鹽度下CW-MFC 體系中的平均出水濃度則高于CW 體系。綜合總無機氮（TIN，TIN=（NH4+-N）+（NO3--N）+（NO2--N））的出水情況以比較2 種體系的脫氮性能，2 種鹽度下CW-MFC 體系中TIN 的平均出水質(zhì)量濃度分別為8.28，9.23 mg/L，分別低于相應(yīng)CW 體系的8.90，10.55 mg/L?？梢姳狙芯恐旭詈螹FC 結(jié)構(gòu)整體上提高了濕地體系的脫氮性能，同時也強化了其對COD 的去除效果。

表2 不同體系中污染物平均出水質(zhì)量濃度 mg·L-1

2.3 微生物機制

微生物作為CW-MFC 體系的重要組成部分，在廢水中污染物的去除方面發(fā)揮了主要作用。研究利用高通量測序?qū)W-MFC 體系和CW 體系陰、陽極區(qū)域的微生物群落進行分析，進一步揭示CW-MFC體系強化高鹽廢水中去除氮的微生物機理。

2.3.1 典型功能菌的豐度比較

陽極是CW-MFC 體系中微生物產(chǎn)電的主要場所，一方面該區(qū)域產(chǎn)電菌可在電勢差的作用下更高效地降解廢水中的有機物，另一方面陽極產(chǎn)生的電子通過外電路到達陰極，在一定程度上能夠緩解陰極反硝化過程中電子供體不足的問題。本研究從屬水平上比較了各體系陰、陽極區(qū)域相關(guān)功能菌的相對豐度，結(jié)果見表3 和表4。

表3 陰極區(qū)反硝化菌的相對豐度 %

表4 陽極區(qū)產(chǎn)電菌的相對豐度 %

由表3 可知，在強化陰極反硝化作用方面，1%鹽度的CW-MFC 體系中反硝化菌共12 類，相對豐度之和為43.07%，而同鹽度的CW 體系中反硝化菌共有9 類，相對豐度之和為31.50%；同樣地，3%鹽度下CW-MFC 體系中的反硝化菌共有7 類，相對豐度之和為26.11%，高于相應(yīng)鹽度下CW 體系中的3 類，后者的相對豐度之和為20.18%。此外，本研究還在CW-MFC 體系的陰極區(qū)發(fā)現(xiàn)了相對豐度較高的Prolixibacter 菌屬，1%和3%鹽度下的相對豐度分別為17.61%和36.38%。盡管目前尚無文獻直接表明該菌屬為反硝化菌，但該菌屬中的Prolixibacter denitrificans 菌種已被認為是一種硝酸鹽還原菌，可利用硝酸鹽作為電子受體將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮[13]。該菌種在2 種鹽度的CW-MFC 體系陰極區(qū)的相對豐度分別為0.04%和0.39%，而相應(yīng)的CW 體系中并未發(fā)現(xiàn)該菌種。綜上可知，來源于陽極區(qū)的電子經(jīng)外電路到達陰極后提高了該區(qū)域反硝化菌的種類和相對豐度，從而更好地強化了CW-MFC 體系的反硝化性能。

由表4 可知，2 種鹽度下CW-MFC 體系陽極區(qū)產(chǎn)電菌的種類和相對豐度均高于相應(yīng)的CW 體系，且Vibrio 菌屬所占的比重大于其他各菌屬，故推斷該菌屬對體系的產(chǎn)電性能貢獻較大。此外3%鹽度的CW-MFC 體系中產(chǎn)電菌的相對豐度之和為54.82%，高于1%鹽度的27.20%，這與3%鹽度的CW-MFC 體系具有更高的輸出電壓一致。較高的輸出電壓意味著更多的電子供體傳入陰極，故而3%鹽度的CW-MFC 體系的反硝化性能更強，其出水中的NO3--N 和NO2--N 濃度均低于1%鹽度的CWMFC 體系的出水濃度。

2.3.2 聚類分析及標志性菌屬

（1）聚類分析

樣本根據(jù)彼此之間的相似度進行聚類，2 樣本間豎向距離越短，表明2 樣本越相似。各體系陰、陽極微生物樣本在屬水平上的層次聚類樹見圖4。

圖4 各體系陰、陽極區(qū)域微生物群落在屬水平上的聚類分析

由圖4 可知，各CW-MFC 體系相同區(qū)域之間的豎向距離最短，表明其相互之間的相似度最高；而CW-MFC 體系與CW 體系之間的豎向距離較長，表明其相互之間的差異性較大?？梢婑詈螹FC 結(jié)構(gòu)明顯改變了各濕地系統(tǒng)陰、陽極區(qū)域的微生物群落組成。

（2）標志性菌屬分析

以上分析表明，耦合MFC 結(jié)構(gòu)顯著改變了濕地體系的微生物群落組成，其中在陰極區(qū)和陽極區(qū)分別富集到了較高豐度的反硝化菌和產(chǎn)電菌。本部分則利用MetagenomeSeq 方法繪制曼哈頓圖來對CW-MFC 體系和CW 體系各區(qū)域的微生物群落進行分析，并找出導致CW-MFC 體系陰、陽極微生物群落與CW 體系產(chǎn)生差異的標志性菌屬，結(jié)果見圖5。圖中每個圓點代表一個OTU，OTU 在其對應(yīng)分組中出現(xiàn)的頻率（p）越大，則其縱坐標值越高。虛線以上的點為在該分組中出現(xiàn)頻率大于0.3 的OTU，橫坐標標識了出現(xiàn)頻率較高的OTU 所對應(yīng)的菌門。而對于出現(xiàn)頻率排在前10 的屬添加黑色或灰色背景，此即為CW-MFC 體系中的標志性菌屬。

圖5 陰、陽極微生物群落在屬水平上的MetagenomeSeq 分析

由圖5（a）可知，相比于CW 體系，CW-MFC 體系陰極區(qū)中具有顯著性差異的OTU 主要分布在Proteobacteria，Bacteroidetes，Spirochaetes，Cyanobacteria，F(xiàn)usobacteria 等菌門中。而從屬水平上看，分布于CW-MFC 體系陰極區(qū)且與CW 體系具有顯著性差異的10 種標志性菌屬中，Lentimicrobiaceae，Desulfovibrio，Aeromonas，Alcanivorax 4 種菌屬是前述表3 中列舉的反硝化菌，且Prolixibacter 菌屬中的Prolixibacter_denitrificans 菌種已被報道為一種典型的硝酸鹽還原菌。此外，RISSANEN A J 等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)用于監(jiān)測鹽水中生物反硝化性能的Methylophaga 菌屬亦能夠?qū)U水中的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮。可見，CW-MFC 體系陰極區(qū)反硝化菌的富集是導致其與CW 體系相應(yīng)區(qū)域在微生物群落組成上產(chǎn)生差異的主要原因。

由圖5（b）可知，相比于CW 體系，CW-MFC 體系陽極區(qū)具有顯著性差異的OTU 主要分布在Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Patescibact －eria，Tenericutes 等菌門中，其中Proteobacteria 是已報道的產(chǎn)電菌存在數(shù)量最多的菌門[15]。而從屬水平上看，分布于CW-MFC 體系且與CW 體系具有顯著性差異的10 種菌屬中，Arcobacter，Vibrio，Aeromonas，Geoalkalibacter，Sulfurovum，Desulfovibrio 等 6種菌屬被報道具有胞外產(chǎn)電能力。因此可認為導致CW-MFC 體系與CW 體系在陽極微生物群落上產(chǎn)生差異主要是由產(chǎn)電菌的富集引起的。

2.4 CW-MFC 體系的電極反應(yīng)機理

CW-MFC 體系電極反應(yīng)機理見圖6，由圖6 可知，由于人工濕地內(nèi)部和表面的溶解氧含量不同，表面好氧區(qū)和內(nèi)部厭氧區(qū)存在著氧化還原電位（ORP）差。將MFC 結(jié)構(gòu)嵌入CW 體系后，低ORP 的厭氧區(qū)形成了CW-MFC 的陽極而高ORP 的好氧區(qū)則形成了陰極。體系陽極區(qū)的產(chǎn)電菌通過分解廢水中的有機物（如葡萄糖等）產(chǎn)生電子（e-）和質(zhì)子（H+），并在較大電位差的驅(qū)動下將電子由外電路傳遞到陰極，從而源源不斷地產(chǎn)生電流。同時在這種長期的電位差馴化下，體系陽極區(qū)的產(chǎn)電菌會逐漸得到富集并成為優(yōu)勢菌種。典型陽極反應(yīng)如下[16]：

圖6 CW-MFC 體系強化脫氮及同步產(chǎn)電機理

陰極區(qū)的電子受體主要為O2，O2可接受來源于陽極的e-和H+生成H2O。此外，廢水中的NO3--N 亦可作為電子受體在反硝化菌的作用下轉(zhuǎn)化為N2脫除。本研究中各CW-MFC 體系在長期運行后，陰極區(qū)反硝化菌的種類和相對豐度均高于相應(yīng)的CW 體系，從而較好地強化了其對NO3--N 的去除效果。相關(guān)陰極反應(yīng)如下[16-17]：

3 結(jié)論

（1）將CW 與MFC 耦合形成的CW-MFC 體系具有穩(wěn)定的輸出電壓，體系陰極區(qū)可由外電路持續(xù)獲得陽極區(qū)產(chǎn)生的電子供體。

（2）利用CW-MFC 體系可強化高鹽廢水中NO3--N的去除，同時產(chǎn)生更少的NO2--N 積累，2 種鹽度下CW-MFC 體系出水中的NO3--N 和NO2--N 濃度均低于相應(yīng)的CW 體系。

（3）高通量測序表明CW-MFC 體系陰極區(qū)反硝化菌和陽極區(qū)產(chǎn)電菌的種類和相對豐度均高于相應(yīng)的CW 體系，且由MetagenomeSeq 分析可知陰極區(qū)反硝化菌和陽極區(qū)產(chǎn)電菌的富集是導致CW-MFC體系與CW 體系在微生物群落組成上產(chǎn)生差異的主要原因。