唐開鋒，歐水平，王玉和，張桂悅，龍 江，王 森

(1.遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099；2.遵義市第一人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099；4.重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400084)

在已經(jīng)開發(fā)或研究的具有良好生物活性的藥物中，難溶或溶解性差的藥占比超過40%[1]，疏水性強成為這類藥物吸收的最大障礙[2]。降低藥物粒徑已成為改善藥物透皮吸收的重要方法之一，隨著納米技術的發(fā)展，將藥物制備成納米制劑已經(jīng)獲得廣泛的發(fā)展，如將藥物制備成納米混懸液、納米脂質體[3]、納米乳、納米囊及納米粒[4]。在透皮給藥系統(tǒng)中，難溶性藥物的粒徑大小也會影響藥物的透皮吸收及皮膚滯留，研究表明，將藥物制備成納米粒徑后，其在體外透皮吸收及皮膚滯留量提高2～3倍以上[5-6]。

吳茱萸次堿(Rutaecarpine，Rut))是蕓香科植物吳茱萸主要的生物活性成分之一，在心血管、神經(jīng)、消化、腫瘤等領域都有廣泛的藥理作用[7]，如激動TRPV1受體[8]、抗Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大[9]等。由于Rut水溶性和脂溶性均較差，口服生物利用低，其油水分配系數(shù)logPow為3.2，適宜透皮吸收，其透皮吸收屏障在于從角質層向親水性活性表皮層的滲透[10]。針對Rut透皮吸收性差的問題，已有采用納米乳[11]、液晶聯(lián)用微針[12]等載體技術，添加促滲劑[13]等促進Rut透皮吸收的研究報道，但尚未見將Rut制成納米混懸制劑促進其透皮吸收的研究報道。本研究將Rut制成Rut微米混懸液(Rut micron suspension，Rut-MS)和Rut納米混懸液(Rut nanosuspension，Rut-NS)，進一步制備成納米混懸凝膠劑(Rut-nanogel)和微米混懸凝膠劑(Rut-microgel)，并進行兩者的透皮吸收和皮膚滯留性能比較研究，以考察藥物粒徑對吳茱萸次堿透皮吸收和皮膚滯留的影響，為Rut納米混懸凝膠劑的研制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 ME204E分析天平(梅特勒-托多利儀器上海有限公司)；AD145S-P超細勻漿機(上海昂尼儀器儀表有限公司)；AH-2010 高壓均質機(ATS Engineering inc)；DL-820D超聲儀(上海之信儀器有限公司)；90 Plus PALS Zeta電位及粒度分析儀(美國布魯克海文儀器公司)；TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠)；PH700型PH測量儀(EUTECH INSTRUMENTS)；RFCD-923電動剃刀(寧波真和電氣股份有限公司)；平頭型數(shù)顯測厚儀(河南埃維特電子科技有限公司)；TK-24BL型透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿易有限公司)；1260Agilent高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

1.2 試藥 吳茱萸次堿對照品(99.70%，成都曼斯特生物科技有限公司)；吳茱萸次堿(91%，陜西昊辰生物科技有限公司)；卡波姆940(美國路博潤公司)；吐溫 80(重慶江川化工有限公司)；泊洛沙姆 188(德國巴斯夫有限公司)；三乙醇胺(成都市科龍化工試劑廠)；甲醇(天津市富宇精細化工有限公司)；聚乙二醇400(成都市科龍化工試劑廠)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(HPLC)(上海月旭科技股份有限公司)；蒸餾水(自制)。

1.3 動物 SPF級雄性SD大鼠5只，健康SD大鼠，清潔級，雄性，體重180～200 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

2 方法

2.1 Rut HPLC測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Ultimate?LP-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：水—乙腈(30∶70)等度洗脫，流速：1.0 mL/min，檢測波長：343 nm，進樣量：20 μL，柱溫：25 ℃。

2.1.2 對照品溶液配制 精密稱取吳茱萸次堿對照品4.87 mg，用甲醇定容到25 mL，超聲(40 W)30 min使其完全溶解，以0.22 μm濾膜過濾，即得194.8 μg/mL的Rut對照品儲備液。

2.1.3 專屬性 分別精密吸取Rut對照品溶液、空白皮膚接收液、空白皮膚滯留液、透皮接收液和皮膚滯留液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

2.1.4 線性范圍 精密吸3.1.2項下對照品儲備溶液適量，用甲醇稀釋至濃度分別為19.48、9.74、4.87、2.43、1.2175、0.608 7 μg/mL的系列對照品溶液。分別精密吸取上述溶液20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標，Rut質量濃度為橫坐標，進行線性回歸，得到標準曲線方程。

2.1.5 精密度和穩(wěn)定性 精密吸取透皮接收液，按2.1.1項下色譜條件進樣6次，記錄鋒面積，計算Rut峰面積RSD。取同一透皮接收液，分別在0、2、4、8、12、24按2.1.1項下條件進樣測定，計算Rut濃度RSD值。

2.1.6 回收率實驗 精密取24 h的透皮接收液0.5 mL，分別加入高、中、低3個質量濃度的Rut對照品溶液0.5 mL各3份，混合均勻后用0.22 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，按2.1.1項下色譜條件精密量取20 μL進樣，測定Rut含量，計算回收率。

2.2 Rut-microgel和Rut-nanogel的制備和表征

2.2.1 Rut-MS和Rut-NS的制備稱 取泊洛沙姆1 880.5 g、吐溫801.0 g，加入100.0 g水，超聲至完全溶解，再取Rut 0.24 g，在20 000 r/min高剪切下加入上述溶液中，繼續(xù)高剪切3 min，即得Rut-MS。Rut-MS再經(jīng)140 MPa高壓均質5 min，制得Rut-NS。

2.2.2 Rut-MS和Rut-NS的粒徑測定 分別取Rut-MS和Rut-NS適量，加蒸餾水稀釋80倍，超聲(40 W)1 min采用90 Plus PALS Zeta 電位及粒度分析儀測定粒徑、PDI，測量波長 659 nm、溫度25 ℃，入射角度90 ℃，測量次數(shù)5次。

2.2.3 Rut-microgel和Rut-nanogel的制備 分別取Rut-MS和Rut-NS 20 g，與0.48%卡波姆940溶液2.4 g混合均勻，加三乙醇胺調節(jié)pH約為6.5，即得Rut-microgel和Rut-nanogel。

2.2.4 Rut-microgel和Rut-nanogel的含量測定 分別精密稱取2.2.3項下Rut-microgel和Rut-nanogel 0.025 g，加入甲醇稀釋100倍，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，計算Rut含量。

2.3 體外透皮實驗

2.3.1 SD大鼠皮膚的處理 取健康SD大鼠，用電剃刀除去背部鼠毛，將大鼠斷頸處死；用剪刀將背部皮膚剪下置生理鹽水中，小心除去皮下組織、血管及脂肪，用生理鹽水反復沖洗，并檢查其完整性；放入-20 ℃冰箱備用。使用時，將皮膚在室溫下用生理鹽水解凍后，用濾紙吸干，剪至合適大小，并測定其厚度。

2.3.2 體外透皮吸收試驗 以SD大鼠皮膚為擴散屏障，采用改良Franz透皮擴散試驗儀進行體外透皮實驗，將處理好的皮膚剪成2 cm×2 cm大小12份，平均分為兩組，兩組間總厚度差異為0.026 mm；剪切好的大鼠皮置于擴散池與接收池之間，真皮層面向接受池，用夾子夾緊，防止漏液。接收池中放入磁力攪拌子，并分別加入透皮吸收接收液(30%PEG400-30%乙醇-生理鹽水)8 mL，于37±0.01 ℃， 350 r/min的攪拌平衡30 min，棄掉接收液，重新加入接收液8 mL；分別用減量法加入Rut-microgel和Rut-nanogel各6份，每份1.20 g，涂抹均勻，在上述溫度和攪拌條件下進行體外透皮吸收試驗；在2、4、6、8、10、12、24 h取樣2 mL，同時補充相同體積的新鮮接受液，將取出的接收液在10 000 r/min離心10 min，即得透皮接收液。透皮吸收試驗結束后取下皮膚，用新鮮接收液清洗表面殘留凝膠，濾紙吸干，剪碎后加入甲醇5 mL超聲提取2次，每次30 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，得皮膚滯留液。按2.1.1項下色譜條件進樣測定透皮接收液和皮膚滯留液中Rut濃度。

2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

2.4.1 透皮吸收參數(shù) 按公式(1)計算取樣時間t內的累積透過量Qt，將Qt與t作圖得透皮吸收曲線，將直線部分進行線性回歸，求出直線斜率，即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js，直線與橫軸的相交點即為時滯tlag。

(1)

式中Qt為第n次取樣時的累積透過量，Vr代表接收液體積(8 mL)，Ct為每個取樣點濃度(μg/mL)，Vs為取樣體積(2 ml)，Ci為第i次取樣測得的接收液中Rut濃度，A為擴散滲透面積(3.46 cm2)。

2.4.2 皮膚滯留量 按式(2)計算皮膚滯留量QS：

QS=V'C/A

(2)

式中V′為提取皮膚液總體積(6 mL)，C為皮膚提取液藥物總濃度，A為擴散滲透面積(3.46 cm2)。

3 結果

3.1 Rut HPLC測定方法的建立

3.1.1 專屬性HPLC色譜圖 結果表明Rut主峰的峰形良好，基線平穩(wěn)，供試品溶液與對照品溶液的主峰保留時間一致，供試品溶液中其他組分對主峰不產生干擾，專屬性良好(見圖1)。

A：Rut對照品溶液；B：空白皮膚接收液；C：皮膚接收液；D：空白皮膚滯留液；E：皮膚滯留液。圖1 HPLC色譜

3.1.2 線性范圍 Rut標準曲線方程為C=64.5112X+37.1153，R2=0.9996，表明Rut濃度在0.6087～19.48 μg/mL內有良好的線性關系。

3.1.3 精密度和穩(wěn)定性 按2.1.5記錄峰面積，計算Rut峰面積的RSD為0.74%，表明HPLC儀器精密度良好。取同一透皮接收液，分別在2.1.5項下時段進樣測定，計算Rut濃度的RSD為1.21%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

3.1.4 回收率試驗 按2.1.6項下方法，測定Rut含量，計算回收率，結果見表1。結果Rut的回收率90%～130%，各組RSD均<5%，說明本方法的回收率符合生物樣品的分析要求。

表1 回收率實驗結果(n=9)

3.2 Rut-microgel和Rut-nanogel粒徑和含量測定Rut-MS和Rut-NS的粒徑分別為(1 317.46±107.27、211.66±1.06) nm，PDI分別為0.367±0.029、0.233±0.011，Rut-microgel和Rut-nanogel中Rut含量分別為21.11、20.12 mg/g。

3.3 Rut-microgel和Rut-nanogel透皮吸收和皮膚滯留參數(shù)Rut-microgel和Rut-nanogel的透皮吸收和皮膚滯留參數(shù)見表2，透皮吸收曲線見圖2。結果表明，Rut-nanogel的透皮吸收速度明顯高于Rut-microgel，在透皮吸收的前6h內Rut-nanogel吸收呈直線上升趨勢，Q24是Rut-microgel的1.62倍，tlag減少6.24min，Js是Rut-microgel的2.12倍，而Rut-microgel的Qs是Rut-nanogel的2.16倍。

表2 透皮吸收參數(shù)及皮膚滯留量

圖2 Rut-microgel和Rut-nanogel透皮吸收曲線

4 討論

本研究初步證明了將Rut的粒徑從微米級(1 317.46±107.27 )nm降低到納米級(211.66±1.06) nm，以有限劑量給藥在離體大鼠背部皮膚透皮吸收試驗中，可有效地提高其透皮吸收速度、累積透過量，有利于Rut外用制劑迅速透皮吸收，發(fā)揮局部或全身治療作用。

研究表明，納米混懸制劑促進藥物透皮吸收和皮膚滯留和以下原理有關：①難溶性藥物粒徑減小至納米級后溶解度增加。有研究證實，將Rut粒徑從1 μm減少至200 nm后，可大幅增加其溶解度，口服吸收總量增加9倍[14]。②NS皮膚給藥以后能使藥物在皮膚表面處于過飽和狀態(tài)，增加了經(jīng)皮滲透的濃度梯度，加速了藥物的透皮擴散。③小于40 nm的藥物可以直接進入毛囊后溶解擴散，750 nm以下粒徑的藥物可以納米粒的形式滲透進角質層，在毛囊中積累，并在角質層和毛囊中溶解，維持局部的過飽和濃度，促使藥物向附近組織滲透擴散[5,15]。Rut-nanogel促進Rut透皮吸收是否與Rut納米粒更多蓄積在毛囊而持續(xù)擴散有關，有待進一步研究Rut-nanogel的透皮吸收途徑和在皮膚中的分布。

大量研究證實，納米混懸液能通常能增加藥物的皮膚滯留量，但本次試驗的結果卻顯示納米混懸液的皮膚滯留量更少，其原因應與本次試驗中采用的有限劑量給藥(約40 μg/cm2)有關，Rut粒徑降低后，溶解性增大，加快了滲透速率，經(jīng)過24 h的滲透，已經(jīng)基本完全擴散進入接收液中，使得皮膚滯留量大幅減少，而在普通混懸凝膠中，Rut粒徑大，溶解率低，滲透性差，使得藥物更容易累積在皮膚中，從兩項的累積透過量及時滯時間比較，也能證實了這一原因。有待進一步采用無限劑量給藥進行透皮吸收試驗，驗證減小Rut粒徑至200 nm左右是否會增加其皮膚滯留量。