嚴(yán)庭發(fā) 蘭淑惠 丁野 徐林

(1定安龍湖南科食用菌有限公司海南定安 571200;2中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)廣西有限公司廣西南寧 530000;3中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物研究所海南?？?571101;4海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南海口 571101)

靈芝是擔(dān)子菌門（Hymenomyeetes）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporace）、靈芝 科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌［1］。在中國(guó)傳統(tǒng)文化中，靈芝自古以來(lái)就被視為一種珍貴藥材，俗稱“瑞草”“靈芝草”“萬(wàn)年蕈”等。在中國(guó)最古老的藥典《神農(nóng)本草經(jīng)》中，靈芝被列為上等藥品，有“帝王之藥”之稱［2］。靈芝之所以備受推崇經(jīng)久不衰，得益于其可食可補(bǔ)可藥的強(qiáng)大功效。臨床試驗(yàn)證明，靈芝具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降血糖、改善人體睡眠質(zhì)量等功能［3-6］。靈芝的有效成分有數(shù)十種之多，包括多糖類、三萜類、腺苷類、生物堿類、多肽氨基酸類等［7］，其中多糖類和三萜類化合物與其藥理活性密切相關(guān)，是靈芝的主要活性成分［8-10］，且靈芝的三萜含量及種類已成為評(píng)價(jià)靈芝品質(zhì)的重要指標(biāo)。

海南省位于中國(guó)南部，屬熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，整個(gè)島嶼全年氣候溫和，雨量充沛，得天獨(dú)厚的自然條件極為適合靈芝生長(zhǎng)。靈芝在中國(guó)分布范圍廣泛，多分布于南方，以海南的種類最為豐富，其中不乏海南特色靈芝，如喜熱靈芝［11］等。近年來(lái)，靈芝的藥用價(jià)值在民間受到越來(lái)越多的重視，彎柄靈芝（Ganoderma flexipes）、黑靈芝（Ganoderma atrum）、無(wú)柄紫靈芝（Ganoderma mastoporum）等品種在海南民間都可作為靈芝（Ganoderma lingzhi）的代替品種使用，且售價(jià)頗高，導(dǎo)致海南地區(qū)靈芝的野生資源急劇減少［12］。由此可見，海南靈芝市場(chǎng)需求及其特有野生資源的保護(hù)都不能忽視。本研究對(duì)收集到的12個(gè)靈芝菌株進(jìn)行引種及生理特性和三萜成分分析，以期為海南靈芝栽培及選育和特有野生靈芝資源的保育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試靈芝菌株共12個(gè)，具體信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 靈芝菌株菌絲體生理特性分析

靈芝菌絲體的復(fù)壯及擴(kuò)繁使用馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、自然pH，以121℃滅菌20 min后備用。

溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基（CPDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、供試碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖、糊精）20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、供試氮源（蛋白胨、麥麩、尿素、牛肉膏）3 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、自然pH，121℃滅菌20 min后備用。

表1 參試靈芝菌株信息

pH試驗(yàn)培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖分別為200、20 g/L、瓊脂粉20 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L，H2SO4（1 mol/L）、NaOH（1 mol/L），分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 5、6、7、8、9，以121℃滅菌20 min后備用。

采用平板劃線法，每隔24 h標(biāo)記一次菌落直徑，觀察菌落顏色和氣生菌絲密度，至任一菌株長(zhǎng)滿平板后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度（平均菌落直徑/菌絲生長(zhǎng)天數(shù)）。每處理3個(gè)重復(fù)，除不同溫度梯度實(shí)驗(yàn)外均以25℃培養(yǎng)。

1.2.2 靈芝菌株出菇情況測(cè)試

母種培養(yǎng)基為CPDA培養(yǎng)基，以121℃滅菌20 min后備用。

原種培養(yǎng)基配方為：棉籽殼84%，麩皮15%，石膏1%。栽培料配方為：棉籽殼40%，麥麩10%，木屑47%，3%熟石灰。上述培養(yǎng)基在121℃滅菌150 min后備用。

將接種后的菌包置于海南省定安縣的大棚內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)菌期間環(huán)境溫度控制在25℃左右，出菇時(shí)溫度自然，環(huán)境濕度控制在65%～85%，觀察是否可以正常出菇及出菇形態(tài)。

1.2.3 不同靈芝菌株品種鑒定

采用ITS序列分析法對(duì)不同靈芝菌株進(jìn)行品種鑒定［13］。方法如下：使用百泰克真菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取靈芝基因組DNA，選用2條特異引物ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC）對(duì)各靈芝菌株基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到目的擴(kuò)增片段后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往華大基因測(cè)序；得到各靈芝菌株ITS序列后，用BLAST工具進(jìn)行同源序列比對(duì)，使用統(tǒng)計(jì)軟件MegaX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同靈芝菌株子實(shí)體總?cè)坪繙y(cè)定分析

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取適量齊墩果酸對(duì)照品粉末，用甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液；分別精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于15 mL具塞試管；將試管置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)并將液體抽干；精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，用冰醋酸溶解成10 mL的溶液即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分搖勻；于70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL；各試管臨測(cè)定前搖勻，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 總?cè)铺崛〖皺z測(cè)

（1）提取將真空冷凍干燥后的子實(shí)體研磨成粉末，精密稱取1 g粉末置于50 mL離心管中，加入25 mL乙醇，以超聲功率100 W處理55 min；過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，共提取2次；用乙醇分次洗滌濾器和濾渣，將洗液放入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，備用。

（2）檢測(cè)精密量取上述總?cè)迫芤?.2 mL，置于15 mL具塞試管中，將試管置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)并抽干液體，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分搖勻，以70℃水浴15 min；取出后立即冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，各試管臨測(cè)定前搖勻；以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出三萜溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算即得樣品中三萜含量。

1.2.5 不同靈芝菌株子實(shí)體三萜類化合物指紋圖譜分析

總?cè)铺崛〖皽y(cè)定方法參考專利“一種靈芝中17種三萜化合物含量的檢測(cè)方法”（專利號(hào)：CN 108181396 A）所描述的方法進(jìn)行［14］，具體方案如下：將靈芝子實(shí)體研磨成粉末狀，加入乙酸乙酯（料液比為1∶20，m∶V），以60℃加熱超聲提取30 min后離心收集上清，將上清抽濾凍干后獲得濃縮物；使用色譜級(jí)甲醇將濃縮物復(fù)溶（料液比為1∶1，m∶V），用0.22μm孔徑有機(jī)相微孔濾膜將復(fù)溶液過濾；采用高效液相色譜法測(cè)定靈芝三萜類化合物指紋圖譜，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為25℃，流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈-水（含有0.01%冰醋酸），梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌株品種鑒定結(jié)果

將獲得的ITS序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（圖1），其中供試菌株A、B、K、C、I、H、F與Gano‐derma lingzhi聚為一支；供試菌株E、G與無(wú)柄靈芝屬（Ganoderma sessile）聚為一支；供試菌株D與紫芝（Ganoderma sinense）聚為一支；供試菌株J與新日本靈芝（Ganoderma neojaponicum）聚為一支；供試菌株L與有柄樹舌（Ganodermagibbosum）聚為一支。

圖1 基于ITS序列的菌株間系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同靈芝菌株菌絲體生理特性

綜合評(píng)估菌絲體在平板上的生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)及菌絲體疏密程度，篩選得到各靈芝菌株的最適碳源、最適氮源及最適pH值，如表3所示（p＜0.05）。

表3 各靈芝菌株的最適碳氮源和pH值

由表3可知，不同靈芝菌株的生長(zhǎng)條件略有不同，蔗糖為供試靈芝菌株生長(zhǎng)的最適碳源；麥麩或牛肉膏均可作為供試靈芝菌株生長(zhǎng)的氮源，其中麥麩較為普試；供試靈芝菌株為中高溫型菌株，25～30℃較適合靈芝菌絲體生長(zhǎng)；pH 5～7時(shí)，供試靈芝菌株菌絲體長(zhǎng)勢(shì)較好，表明中性偏酸性的環(huán)境較適合供試靈芝菌絲體的生長(zhǎng)。

2.3 不同靈芝菌株出菇測(cè)試結(jié)果

共栽培12個(gè)不同靈芝菌株，其中6個(gè)菌株可在海南省定安縣正常出菇，出菇形態(tài)如圖2所示。菌株K形狀圓潤(rùn)，菌蓋表層集聚了噴射的孢子粉，去除孢子粉后表面光滑；菌株F可形成層狀菌蓋；菌株I分支較多，菌柄細(xì)長(zhǎng)，無(wú)菌蓋，狀如珊瑚；菌株H菌蓋為圓形，較圓潤(rùn)；菌株J菌柄細(xì)長(zhǎng)，菌蓋偏生且較小。

圖2 供試品種子實(shí)體情況

2.4 不同靈芝菌株子實(shí)體總?cè)票壤治鼋Y(jié)果

6種待測(cè)樣品的總?cè)票壤几哂谥袊?guó)藥典（2020版）要求的0.5%，其中菌株F子實(shí)體總?cè)票壤罡?，達(dá)到1.44%（圖3）；菌株G與菌株J總?cè)票壤^低，分別為0.99%和0.92%。

圖3 供試品種子實(shí)體總?cè)票壤?/p>

2.5 不同靈芝菌株子實(shí)體三萜類化合物色譜圖譜分析結(jié)果

采用高效液相色譜法分析靈芝菌株F、G、H、I、J、K子實(shí)體三萜類化合物，得到各靈芝子實(shí)體色譜指紋圖譜，如圖4所示。除菌株J基線不穩(wěn)、后期較高外，其余各靈芝三萜類化合物液相色譜圖基線較好。各色譜峰分離也較好，滿足后續(xù)分析要求。由三萜化合物指紋圖譜（表4）相似度可知，菌株H、K、G所含有的三萜化合物相似度較高，菌株J、F所含有的三萜化合物相似度較高，菌株I所含有的三萜類化合物與其它菌株均有較大差異。

表4 各供試靈芝菌株間三萜化合物指紋圖譜相似度

圖4 靈芝子實(shí)體指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

海南獨(dú)特的熱區(qū)生境適宜開展靈芝生產(chǎn)栽培。適宜海南栽培的品種對(duì)海南靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展起關(guān)鍵作用。根據(jù)靈芝產(chǎn)品用途主要分為觀賞和藥用兩大類型。觀賞靈芝主要關(guān)注子實(shí)體性狀，通常造型奇特的子實(shí)體更具觀賞性。由于審美的差異性，人們對(duì)靈芝造型的喜好各有不同，本研究篩選到的珊瑚靈芝（I）形態(tài)與其他靈芝具有較大差異，且無(wú)需高二氧化碳環(huán)境誘導(dǎo)，具有一定的便捷特點(diǎn)。此外，觀賞靈芝可采用基于加定型模具的生長(zhǎng)期控制法和彎曲、分割、固定、嫁接、插接、靠接等后期造型控制措施［15］來(lái)實(shí)現(xiàn)。藥用是靈芝的主要用途。隨著國(guó)家食藥監(jiān)局對(duì)靈芝既是食品又是藥品試點(diǎn)工作的推進(jìn)，靈芝產(chǎn)業(yè)將進(jìn)一步擴(kuò)大，對(duì)栽培靈芝的需求將越來(lái)越大。靈芝三萜類化合物作為靈芝的主要活性物質(zhì)［16］，因具有保肝護(hù)肝、抗高血壓、抗HIV-1活性、抗氧化、抗腫瘤等作用［8，17］而一直備受關(guān)注。目前從靈芝中分離得到的三萜類化合物已達(dá)300多種［18］。有研究表明，不同品種靈芝的三萜種類和含量存在差異，而黑芝幾乎不含三萜類有效成分［19］。作為一種藥用原料，當(dāng)開發(fā)生產(chǎn)傾向于保肝護(hù)肝作用的藥物或保健品等時(shí)，應(yīng)選擇三萜類含量較高的靈芝菌株［20］。本研究顯示，盆景靈芝（F）三萜類化合物達(dá)到1.44%、南韓靈芝（H）達(dá)到1.41%，可作為海南靈芝栽培的優(yōu)質(zhì)菌株。

此外，以彎柄靈芝為代表的特色靈芝資源是海南優(yōu)勢(shì)資源，應(yīng)加強(qiáng)該類靈芝資源的保護(hù)利用。彎柄靈芝是一類主要分布于熱帶區(qū)域、子實(shí)體菌柄細(xì)長(zhǎng)、菌蓋較小的靈芝，因其藥用價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)售價(jià)逐年增高。目前，該類靈芝的民間名稱還不統(tǒng)一，有待進(jìn)一步規(guī)范。本研究中彎柄靈芝菌株（J）分離于竹子根部，根據(jù)形態(tài)特征和生境特點(diǎn)，民間命名為竹靈芝；但I(xiàn)TS序列比對(duì)分析表明，其與Ganoderma neojaponi‐cum序列的相似度為100%；而Cao等［1］利用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法證實(shí)黑芝（Ganoderma atrumJ.D.Zhao 1979）、喜熱靈芝（Ganoderma cali‐dophilumJ.D.Zhao 1979）、海南靈芝（Gano‐derma hainanenseJ.D.Zhao 1979）、小馬蹄靈芝（Ganoderma parviungulatumJ.D.Zhao & X.Q.Zhang 1986）是Ganoderma flexipes的 同 物 異名［1］，因此菌株J實(shí)際上應(yīng)為Ganoderma flexi‐pes，中文名為彎柄靈芝。

3.2 結(jié)論

靈芝（K）、盆景靈芝（F）、盆景靈芝3號(hào)（G）、珊瑚靈芝（I）、南韓靈芝（H）、彎柄靈芝（J）可根據(jù)需求在海南地區(qū)栽培。盆景靈芝（F）、南韓靈芝（H）更適合于對(duì)總?cè)坪恳蟾叩撵`芝生產(chǎn)，而珊瑚靈芝（I）更適合用于制作盆景靈芝。開展栽培時(shí)，種植戶可根據(jù)各品種最適的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)平板菌種或液體菌種。蔗糖、麥麩或牛肉膏可作為通用性菌種培養(yǎng)基配方。