彭 彬,許明明,王光鎖,李國鋒

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，男性高于女性，占男性惡性腫瘤首位，女性惡性腫瘤第2位[1]。NSCLC最有效治療方法為手術(shù)切除，但超過50%患者在確診時已處于癌癥晚期，甚至已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，不具備手術(shù)切除的臨床條件，臨床多以化療、靶向治療或免疫治療為主。NSCLC傳統(tǒng)化療特異性差，且具有嚴重的毒副作用，臨床應(yīng)用局限。吉非替尼作為第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR TKI)，是最常見的治療攜帶第19外顯子缺失和(或)第21外顯子錯義突變(L858R)的分子靶向藥物之一[2-3]。EGFR TKI結(jié)合EGFR受體激酶區(qū)阻斷EGFR自磷酸化，抑制下游RAS/ERK和(或)PI3K/AKT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，逆轉(zhuǎn)NSCLC進程；但絕大多數(shù)患者在接受EGFR TKIs治療6～12個月后就會出現(xiàn)不同程度的耐藥反應(yīng)[4-5]，因此，迫切需要開發(fā)新治療方案克服EGFR TKIs耐藥性。血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF/VEGFR)信號通路異常激活被認為是腫瘤新生血管形成的重要因素[6-7]。貝伐珠單抗是人源化抗VEGF單克隆抗體，可通過阻斷VEGF/VEGFR信號通路抑制腫瘤新生血管形成發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。研究表明，EGFR與VEGF信號通路有密切關(guān)系[9-10]。當對EGFR-TKI出現(xiàn)耐藥性時，VEGF依賴的信號可能是一種替代的生存途徑[11]。EGFR TKI與貝伐珠單抗聯(lián)合療法可顯著延長無進展生存期(PFS)，降低腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率[12]。一線吉非替尼治療失敗后，二線鉑類聯(lián)合培美曲塞或貝伐珠單抗可能會改善患者PFS[13]。體外模型中的研究表明貝伐珠單抗還具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]，但其作用機制尚不清楚。本研究以吉非替尼耐藥細胞系(NCI-H1975)為研究對象，評估吉非替尼+貝伐珠單抗聯(lián)合治療是否能夠逆轉(zhuǎn)NSCLC對吉非替尼耐藥，旨在為吉非替尼聯(lián)合貝伐珠單抗的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及實驗動物 實驗細胞系NCI-H1975細胞系購買自中國醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所細胞培養(yǎng)中心。SPF級5～6周齡雌性裸鼠24只，購自西普爾-必凱公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。自由進食水，12 h/12 h明暗周期，實驗經(jīng)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2實驗試劑及儀器 吉非替尼(上海蓓瑯生物科技有限公司)；貝伐珠單抗(Genentech)；細胞培養(yǎng)試劑RPMI 1640、胎牛血清、胰酶和噻唑藍(MTT)均購自Gibco；多聚甲醛(Sigma)；兔源抗CD3和CD31抗體、HRP標記羊抗兔IgG二抗均購自Abcam公司；抗p-ERK抗體、抗p-AKT抗體和抗mTOR抗體均購自CST公司。儀器酶標儀(上海赫冠儀器有限公司)、游標卡尺(日本三豐)、正置顯微鏡和倒置顯微鏡(奧林巴斯)；電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；細胞培養(yǎng)箱(上海向帆儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1吉非替尼耐藥NCI-H1975細胞系構(gòu)建：將NSCLC H1975細胞系在含有12 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，經(jīng)RPMI 1640清洗去除死亡細胞，收集活性細胞在不含吉非替尼的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合至80%，按比例加入吉非替尼至濃度12 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述操作，以5 μmol/L梯度增加吉非替尼濃度直到吉非替尼濃度達80 μmol/L。存活細胞即為NCI-H1975細胞系，繼續(xù)在不含吉非替尼培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周用作后續(xù)研究。方法參照Zhao等[1]報道。

1.3.2MTT檢測：將NCI-H1975細胞系接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，分別加入含有0、2.5、5、10、15、20和25 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基，于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。沿孔壁緩慢加入MTT溶液，每孔20 μl，繼續(xù)孵育3～4 h。2500×g離心10 min，吸棄上清，沿孔壁緩慢加入DMSO重懸細胞，每孔150 μl。最后于450 nm處測量吸光度值。親代H1975細胞系同步處理用作對照，經(jīng)擬合后計算藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，耐藥指數(shù)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.3.3NCI-H1975細胞荷瘤小鼠模型制作：將NCI-H1975細胞以每亳升2×107個的密度接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤體積至約50 mm3時，以隨機數(shù)字表法將荷瘤小鼠分為對照組、吉非替尼組、貝伐珠單抗組、聯(lián)合組，每組6只。吉非替尼組給予吉非替尼50 mg/kg灌胃[14]，1/d；貝伐珠單抗組給予貝伐珠單抗5 mg/kg，腹腔注射，2/d[15-16]；聯(lián)合組給予吉非替尼和貝伐珠單抗，劑量同前；對照組給予等量生理鹽水。腫瘤生長情況于分組后第16天取材檢測。腫瘤體積計算公式為：腫瘤體積=0.5×長徑×短徑2。

1.3.4小鼠腫瘤CD3和CD31檢測：免疫組織化學(xué)染色實驗結(jié)束時，鈍性分離小鼠腫瘤，取其中一部分放入4%多聚甲醛中浸泡48 h后，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后，腫瘤組織經(jīng)切片機(Leica)制作5 μm厚切片。CD3和CD31一抗的孵育濃度分別為1∶500和1∶1000，4℃孵育過夜，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，按比例加入HRP標記二抗(1∶2500)孵育1 h，最后經(jīng)DAB顯色。封片后隨機選取3個視野量化CD3和CD31染色結(jié)果。CD3經(jīng)手動計數(shù)陽性細胞數(shù)量；CD31經(jīng)IPP(6.0版本)計算平均光密度值(IOD)。

1.3.5蛋白免疫印跡：分離腫瘤組織，迅速放入液氮中研磨，加入RIPA裂解后，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白含量，取50 μg蛋白上樣檢測p-ERK、p-AKT和mTOR含量。p-ERK抗體(1∶2000)、p-AKT抗體(1∶2500)、mTOR抗體(1∶2000)、β-actin抗體(1∶2000)，4℃搖床上孵育過夜；次日經(jīng)PBS清洗后按比例加入羊抗兔IgG二抗(1∶3000)，室溫孵育45 min；顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像。相對蛋白含量=目標蛋白WB帶灰度值/β-actin WB帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1吉非替尼對H1975和NCI-H1975細胞形態(tài)和細胞活力的影響 H1975細胞呈長梭狀，NCI-H1975細胞胞體變小，呈橢圓形或圓形。細胞倍增時間分別為H1975細胞(29.5±2.0)h、NCI-H1975細胞(48.6±2.7)h，NCI-H1975細胞倍增時間長于H1975細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。H1975細胞IC50為6.93 μmol/L，NCI-H1975細胞IC50為13.34 μmol/L，耐藥指數(shù)為1.92。見圖1、2。

圖1 H1975和NCI-H1975細胞形態(tài)特征

圖2 不同濃度吉非替尼處理后H1975和NCI-H1975細胞活力比較

2.2貝伐珠單抗抑制NCI-H1975荷瘤小鼠腫瘤情況 治療16 d后，各組小鼠腫瘤體積分別為對照組(1575.9±341.2)mm3，吉非替尼組(1328.7±518.6)mm3、貝伐珠單抗組(918.7±421.0)mm3、聯(lián)合組(498.8±186.0)mm3。對照組與吉非替尼組小鼠腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和吉非替尼組比較，貝伐珠單抗和聯(lián)合組組荷瘤小鼠腫瘤體積增長速度顯著減慢，且聯(lián)合組生長速度較貝伐珠單抗組更緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。見圖3。

圖3 貝伐珠單抗抑制NCI-H1975荷瘤小鼠腫瘤生長情況

2.3貝伐珠單抗治療促進小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+細胞浸潤 4組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+細胞數(shù)量分別為對照組(9.6±2.9)個、吉非替尼組(16.2±3.7)個、貝伐珠單抗組(28.6±4.2)個、聯(lián)合組(66.0±5.8)個。與對照組比較，吉非替尼組、貝伐珠單抗組、聯(lián)合組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD3+細胞浸潤數(shù)均增多，且聯(lián)合組高于貝伐珠單抗組和吉非替尼組，貝伐珠單抗組高于吉非替尼組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖4、5。

圖4 貝伐珠單抗促進荷瘤小鼠腫瘤瘤體內(nèi)CD3+細胞浸潤情況(SP×400)

圖5 4組荷瘤小鼠腫瘤瘤體內(nèi)CD3+細胞數(shù)量比較

2.4貝伐珠單抗治療減少腫瘤組織CD31+內(nèi)皮細胞數(shù)量 4組小鼠腫瘤組織CD31+內(nèi)皮細胞平均光密度值分別為對照組0.96±0.26、吉非替尼組0.76±0.11、貝伐珠單抗組0.46±0.11、聯(lián)合組0.25±0.08。與對照組比較，吉非替尼組、貝伐珠單抗組、聯(lián)合組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD31+內(nèi)皮細胞平均光密度值均顯著降低；且貝伐珠單抗組和聯(lián)合組CD31+內(nèi)皮細胞平均光密度值均低于吉非替尼組，聯(lián)合組低于貝伐珠單抗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。見圖6、7。

圖6 貝伐珠單抗抑制腫瘤組織內(nèi)CD31+細胞增殖情況(SP×400)

圖7 4組荷瘤小鼠腫瘤瘤體內(nèi)CD31+細胞平均光密度值比較

2.5貝伐珠單抗對腫瘤組織AKT和ERK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 對照組與吉非替尼組p-ERK和p-AKT表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，吉非替尼組mTOR表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。與對照組和吉非替尼組比較，貝伐珠單抗組和聯(lián)合組p-ERK、p-AKT和mTOR表達水平均顯著降低，且聯(lián)合組顯著低于貝伐珠單抗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖8。

圖8 貝伐珠單抗治療抑制AKT和ERK信號通路

3 討論

吉非替尼是NSCLC一線治療藥物之一，PFS約11個月[17]，但在連續(xù)治療6～9個月后，因繼發(fā)性EGFR-T790突變或MET擴增，多數(shù)NSCLC會出現(xiàn)獲得性耐藥[18]。針對臨床“吉非替尼耐藥”難題，已有多項研究嘗試吉非替尼+貝伐珠單抗聯(lián)合治療，該方案具有增強藥效克服吉非替尼耐藥的潛力，但具體作用機制尚不清楚[12-13]。

在NSCLC中，EGFR和VEGF信號通路存在交叉[19]，EGFR可通過ERK/PI3K調(diào)控VEGF表達水平，攜帶EGFR突變的腫瘤中VEGF表達水平通常會高于野生型[20-21]。本研究采用靶向VEGF的單克隆抗體藥物，特異性阻斷VEGF/VEGFR通路，以提高耐藥NSCLC對吉非替尼的響應(yīng)；體外誘導(dǎo)NCI-H1975細胞系并構(gòu)建荷瘤小鼠；結(jié)果顯示，吉非替尼對荷瘤小鼠基本無治療效果；可部分恢復(fù)NCI-H1975細胞系對吉非替尼的敏感性，表現(xiàn)為荷瘤小鼠腫瘤體積減小、血管內(nèi)CD31+密度值降低、瘤體內(nèi)CD3+細胞數(shù)量增加和磷酸化AKT/mTOR/ERK蛋白水平降低。AKT/mTOR和ERK信號參與Warburg效應(yīng)，其通過提高糖酵解率，產(chǎn)生乳酸為腫瘤細胞提供能量[22]。因此，聯(lián)合治療阻斷了NCI-H1975細胞的能量供應(yīng)，從而抑制了腫瘤生長。另外，AKT/mTOR和ERK通路也是EGFR和VEGFR信號通路“共通”的下游信號通路，因此，聯(lián)合治療也實現(xiàn)了“雙重”阻斷[14]。在攜帶EGFR突變的NSCLC患者中，吉非替尼+貝伐珠單抗聯(lián)合治療客觀緩解率13%，疾病控制率88%，顯著延長患者PFS[23]，但作用機制鮮有報告。本研究為吉非替尼+貝伐珠單抗聯(lián)合治療吉非替尼耐藥的NSCLC提供了理論依據(jù)。不足在于H1975為NSCLC細胞系，是經(jīng)體外篩選而來，若可通過從EGFR-TKI耐藥患者中提取原代細胞開展此類實驗將使結(jié)果更具有說服力。

吉非替尼+貝伐珠單抗聯(lián)合治療可抑制NCI-H1975細胞荷瘤小鼠的腫瘤生長，減少腫瘤內(nèi)部新生血管生成，增加瘤內(nèi)淋巴細胞浸潤，在一定程度上克服NSCLC的吉非替尼耐藥。貝伐珠單抗可能是EGFR-TKI耐藥后NSCLC患者的一種治療手段，其作用機制有待臨床試驗的進一步證明。