焦淑玲，權科佳，何孝文，毋卓，曾寶平，南禧辰，楊陽

（西安醫(yī)學院 藥學院 藥物研究所，陜西西安710021）

晚期糖基化終末產物（ Advanced Glycation Endproducts，AGEs）是由大分子物質（如氨基酸、蛋白質和核酸）的末端氨基與還原糖（如葡萄糖、戊糖和木糖）的羰基在非酶促條件下發(fā)生親和加成反應，生成可逆的席夫堿，席夫堿發(fā)生Amadori 重排生成穩(wěn)定的醛胺類物質，醛胺類物質經過一系列的脫氫、氧化和重排反應生成羰基化合物，高活性的羰基化合物與蛋白質的自由基、巰基等功能基反應使之變性，最后生成穩(wěn)定的AGEs[1]。按照來源分類，AGEs 分為內源性AGEs 和外源性AGEs。內源性AGEs 主要由體內大分子物質經美拉德反應而來，外源性AGEs 主要來源于含高脂肪、高蛋白質的經高熱、油炸的食品[2]。按照是否自帶發(fā)色基團分類，AGEs 分為非熒光AGEs和熒光AGEs，非熒光AGEs 有羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）、吡咯素（Pyr），熒光AGEs 有戊糖苷和甲基乙二醛賴氨酸二聚體（MOLD）[3]，其結構式如圖1 所示。糖尿病及其并發(fā)癥的引發(fā)，炎癥的產生、病變過程和人體骨質量、骨質交聯(lián)變化等均與AGEs 的體內累積有關[4-6]，食品和生物樣品中AGEs的檢測對于糖尿病及其并發(fā)癥、炎癥的預診和骨折風險的評估等具有指導意義?，F(xiàn)常用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA 法）、光譜法、色譜連用等方法檢測AGEs。

圖1 常見AGEs 結構式

1 ELISA 法

樸奎英等[7]對特應性皮炎（AD）患者和健康者的血樣和角質細胞進行了AGEs、可溶性AGEs 受體（sRAGE）和內源性分泌RAGE（esRAGE）的檢測，利用ELISA 試劑盒對血液和角細胞中的蛋白質表達水平進行定量檢測，用ELISA 抗體檢測CML 表位，通過比較樣品光密度（O.D）和標準曲線來確定每個靶蛋白的濃度。結果顯示，AD 患者角質細胞中AGEs水平要高于健康者，同一患者病變部位與非病變部位平均AGEs 水平無明顯差異，角質細胞中AGEs 水平與AD 患者病情嚴重程度呈正相關；AD 患者與健康者血清中AGEs 的含量幾乎無差異，但AD 患者血清中sRAGE 水平明顯高于健康受試者。蔣明昌[6]利用ELISA 法測定血清戊苷和CML 與體重指數(shù)（BMI）的關系，得出人體BMI 越大，血清戊苷和CML 的含量越低。彭偉等人[8]利用ELISA 法對乳腺癌患者進行血清中AGEs 水平的測定，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組AGEs水平明顯高于乳腺良性疾病組和健康受試組，進一步分析乳腺癌患者治療前血清，發(fā)現(xiàn)AGEs 水平與患者區(qū)域淋巴結轉移狀況及臨床分期密切相關。兩次分析表明AGEs 與乳腺癌的侵襲和擴散有關。有研究顯示，糖尿病與乳腺癌的病程有關，且AGEs 高表達于糖尿病患者和乳腺癌患者體內，因此檢測人血清中AGEs 水平對于治療乳腺癌或糖尿病合并的乳腺癌具有重要意義。

2 光譜法

2.1 傅立葉變換紅外（FTIR）成像法

Schmidt 等人[9]利用傅立葉變換紅外成像檢測不同年齡段人體骨膠原蛋白中非酶交聯(lián)（AGEs）形成過程的光譜變化。非酶交聯(lián)相關的膠原質量的二維（2D）空間分布可通過酰胺Ⅰ峰內1 678/1 692 cm-1子帶的面積比測量，此比值稱為非酶交聯(lián)比（NE-xLR）。結果顯示：隨著組織年齡的增加或骨病態(tài)情況下，骨區(qū)域（即間質骨）中非酶交聯(lián)的積聚增強。

2.2 熒光光譜法

朱健銘等人[10]將AGEs 標準溶液配制成7 種不同的濃度，通過熒光分光光度計對其含量進行檢測，并繪制熒光峰值強度與濃度的標準曲線，發(fā)現(xiàn)以370 nm 為激發(fā)波長，在470 nm 發(fā)射波長處可觀察到明顯的熒光峰值，相關系數(shù)R2=0.997，表明熒光光譜法對離體的AGEs 進行檢測具有可行性。Steenbeke等人[11]以360 nm 作為激發(fā)波長，在400～620 nm 發(fā)射波長范圍內對慢性腎病患者和健康受試者尿中AGEs 的含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)慢性腎病患者尿中的AGEs 含量明顯高于健康受試者。楊成會等人[12]對熒光檢測皮膚AGEs 的方法在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生風險評估中的應用進行了綜述，表明熒光光譜法檢測皮膚AGEs 對糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生風險的預測有一定的臨床意義。

3 色譜聯(lián)用技術

3.1 氣相色譜串聯(lián)質譜法（GC-MS）

CML 為非熒光AGEs，且難揮發(fā)，使用GC-MS 前需對其進行柱前衍生，Wang 等人[13]用甲醇和三氟乙酸對大菱鲆肌肉中的CML 進行羧基酯化和氨基?；肎C-MS 對其進行檢測，發(fā)現(xiàn)CML 三氟乙酰甲酯化衍生物峰面積與濃度在1～200 μg/L 范圍內呈良好線性關系，檢出限為1 mg/kg，定量限為5 mg/kg，且GC-MS 法對于大菱鲆肌肉中CML 的檢測具有較高靈敏度。

3.2 高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）

Chen 等人[14]以鄰苯二甲醛為衍生化試劑在硼酸鈉緩沖溶液（pH=9.7）中對CML 進行衍生，用反相凝膠ODS 柱對CML 進行分離，設置340 nm 為激發(fā)波長，455 nm 為發(fā)射波長，使用FLD 檢測熟肉中CML 的含量，發(fā)現(xiàn)在較高的溫度下經蒸煮、烤制或油炸的肉類產品可產生大量CML，本方法的定量限為5.0 ng/mL，檢出限為1.5 ng/mL。Nakano 等人[15]對測試樣品加熱，使用HPLC-FLD 對加熱樣品中戊糖素苷進行測定，發(fā)現(xiàn)加熱的樣品與未加熱的樣品相比，戊糖素苷的含量增加了1.1～4.2 倍。

3.3 高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UVD）

Pyr 具有強的紫外吸收特性，劉慧琳等人[16]采用固相萃取-HPLC-UVD 對食品中Pyr 含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)Pyr 在5×10-7～2×10-3mol/L 濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，檢測限為5×10-7mol/L。周凱文等人[17]首次將超聲提取法用于Pyr 提取，采取HPLC-UVD 對食品中Pyr 的含量進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)醬油和咖啡中Pyr 的含量最高，分別為18.42 μg/mL、11.27 μg/L。

3.4 高效液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC-MS）

Hull 等[18]人測定食品中CML 時，為增加CML在C18 柱上的保留時間，在洗脫液中加入了離子對試劑，但離子對試劑會降低色譜柱的壽命、污染質譜的離子源。為減小離子對試劑對實驗結果的影響，孫曉華等人[19]換用親水作用色譜柱（HILIC）對食品CML 進行分離，通過HPLC-MS 檢測15 種來源不同的油條中CML 的含量，其含量范圍為（5.3±0.5）～（15.4±0.3）mg/kg，回收率范圍為89.5%～99.1%，相對標準偏差范圍為2.1%～2.6%，儀器的檢出限為1 ng/mL，定量限為3 ng/mL。朱玉潔等人[20]使用固相萃取-UPLC-MS/MS 法對煎炸食物中CML 和CEL的含量進行測定，分析顯示CML 和CEL 在0.01～1.00 μg/mL 濃度范圍內線性良好，相關系數(shù)R2為0.999 4～0.999 5，檢出限均為15.0 μg/kg，定量限均為45.0 μg/kg。Courten 等人[21]用UPLC-MS 檢測尿、血漿和膳食中AGEs 含量，分析食用含有AGEs 的食物對胰島素敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)食用含有AGEs 含量低的食物可以降低尿中AGEs 的濃度，同時可以改善胰島素的敏感性。

對AGEs 的定性分析，HPLC-MS 應用也較廣泛。Nomi 等人[22]利用HPLC-MS 對啤酒中AGEs 進行分析，首次證明了啤酒中存在CML、CEL。Zhang 等人[23]利用HPLC-MS 對生杏仁和熟杏仁中AGEs 進行分析測定，發(fā)現(xiàn)生杏仁與熟杏仁中均含有CML 和CEL，且首次在烤杏仁中發(fā)現(xiàn)了嘧啶。

細胞膜固相色譜是以生物大分子作為固定相，化學成分作為流動相的一項新興色譜技術，主要研究生物大分子與化學成分之間的關系。朱毛毛等人[24]采用細胞膜固相色譜技術對奶粉中存在的特異性AGEs進行篩選，HPLC-MS/MS 對其進行分析，發(fā)現(xiàn)牛奶中主要含有CML、CEL、Pyr 三種AGE。CML、CEL檢出限為1 ng/mL，定量限為5 ng/mL；Pyr 檢出限為3 ng/mL，定量限為7 ng/mL。

4 糖基化終產物檢測儀（AGE-reader）

AGE-reader 主要由紫外線燈管、光纖、光譜儀組成。紫外線燈管發(fā)出一定范圍的激發(fā)光，使皮膚中熒光AGEs 產生熒光，通過光纖接受，將觀察到的自體熒光性表達為AFR（可以與熒光反應的AGEs 的含量）。Hagen 等人[25]利用AGE-Reader 來檢測人前臂掌側內的AGEs，通過皮膚自發(fā)熒光強度（SAF）來反映AGEs 在皮膚中的濃度與情感障礙之間的關系，其中SAF 指皮膚AGEs 含量的高低，研究發(fā)現(xiàn)SAF 與情感障礙中抑郁癥的發(fā)病率略有關聯(lián)，與其他情感障礙的持續(xù)或復發(fā)無顯著關聯(lián)。

5 AGEs 熒光檢測儀（DM Scan）

DM Scan 的基本原理是采用安全光源激發(fā)人體皮膚的熒光性AGEs，根據(jù)獲得的光學信號來反應AGEs 的積聚量。劉林等人[26]以370 nm 單色光作為激發(fā)波長，用DM Scan 檢測社區(qū)自然人群皮膚中AGEs 的SAF，以此探討社區(qū)自然人群皮膚中AGEs的SAF 與動脈粥樣硬化斑塊的關系，用統(tǒng)計學方法比較和計算有頸動脈粥樣硬化和無頸動脈粥樣硬化受試者的SAF 值，計算得P＜0.001，表明差異有統(tǒng)計學意義。此實驗證明在吸煙人群中，SAF 高值組患頸動脈粥樣硬化斑塊的風險是SAF 低值組的1.903倍，P=0.001，表明SAF 與頸動脈粥樣硬化獨立相關。

6 熒光傳感檢測法

Liu 等人[27]利用熒光傳感檢測法檢測嬰幼兒配方奶粉、面包以及巴氏消毒牛奶中的CML。其原理是以半導體納米材料-量子點為熒光核心，3-氨丙基-3-乙氧硅烷為功能單體，四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，建立CML 分子印跡聚合物，進而檢測食品中CML 含量[4]。發(fā)現(xiàn)在5～400 ng/mL 濃度范圍內，被檢測物質的相對熒光強度隨著CML濃度的升高而下降，此法檢測限為2.6 ng/mL。

7 結語

AGEs 在體內的堆積不僅會提高骨折風險、增強乳腺癌的侵襲和轉移能力還會引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥。對血清、皮膚等生物樣本中AGEs 的檢測可監(jiān)測糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展狀況，監(jiān)測血清中AGEs 水平對于建立乳腺癌及糖尿病合并乳腺癌的診斷、治療方法具有深遠意義，對食品中外源性AGEs 的檢測可以為糖尿病、乳腺癌、抑郁癥患者提供飲食指導。

目前用于AGEs 檢測的方法雖多，但具有一定的局限性。ELISA 法利用待測抗原和固有抗原競爭結合來測定待測樣品中的AGEs，此方法雖靈敏性高、特異性高、操作簡便，但AGEs 作為抗原時在體內可以與自身抗體反應生成抗原抗體復合物影響檢測結果。傅立葉紅外光譜法操作簡單易行，熒光光譜法具有較好的準確性、穩(wěn)定性和較強抗干擾能力，可實現(xiàn)對AGEs 的快速定量檢測。AGEs Reader、熒光傳感器等新技術檢測限低，靈敏度高，樣品耗費少，但也只適用于熒光性AGEs。色譜聯(lián)用技術雖具有高效性、靈敏度高、分辨率高等特點，但大部分AGEs 都為非熒光AGEs，而采用色譜聯(lián)用技術均需柱前衍生，操作復雜耗費高，因此難在臨床中普及。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)可以同時檢測熒光性和非熒光性AGEs 的檢測方法，標準化的AGEs 檢測方法也尚未建立。