韋祥銀

（潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可產(chǎn)生芽孢，屬于嗜堿桿狀細(xì)菌，產(chǎn)過(guò)氧化氫酶和氧化酶，可降解明膠和淀粉、還原硝酸鹽?？藙谑涎挎邨U菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶在清潔劑、絲綢脫膠、皮革工業(yè)、食品工業(yè)、制藥行業(yè)、攝影行業(yè)及生活垃圾處理等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-3]?？藙谑涎挎邨U菌作為堿性蛋白酶天然分泌的優(yōu)勢(shì)菌株之一，有著重要的應(yīng)用前景及價(jià)值[4-5]。

克勞氏芽孢桿菌除了產(chǎn)堿性蛋白酶，還具有益生菌功能，其產(chǎn)生的芽孢具有很強(qiáng)的抗逆性，具有耐酸、耐堿和耐膽鹽特性，可順利通過(guò)人體胃、膽汁，到達(dá)腸道后萌發(fā)，刺激人體免疫反應(yīng)，可用于治療兒童和成人腹瀉和便秘問(wèn)題[6-8]。

本文利用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 的培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，得到克勞氏芽孢桿菌BC-G21 的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，為克勞氏芽孢桿菌發(fā)酵研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

克勞氏芽孢桿菌BC-G21，潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)提供。

芽孢發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.3 g/L、氯化鈣3 g/L、七水硫酸鎂0.25 g/L、一水硫酸錳0.05 g/L、pH調(diào)至中性。

改良的LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L、pH 調(diào)至9.5。

1.2 儀器和設(shè)備

HH-W600 數(shù)顯恒溫三用水箱，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；百倫BLBIO15 型發(fā)酵罐，上海百倫生物科技有限公司；SKY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1 mL 和200 μL 移液器，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

一級(jí)種子：BC-G21 甘油管接入改良LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子：將活化后的菌種按體積比2%接種到裝有50 mL 改良的LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 三角瓶發(fā)酵及芽孢活菌數(shù)計(jì)數(shù)

上述二級(jí)種子按2%體積分?jǐn)?shù)接種至裝有200 mL液體LB 改良培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 h。發(fā)酵培養(yǎng)液利用連續(xù)梯度稀釋方法進(jìn)行稀釋，計(jì)數(shù)試管于80 ℃水浴10 min 后迅速冷卻，加至提前倒置好的改良LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

以芽孢發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為起始培養(yǎng)基，選擇添加量為5 g/L 的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、玉米淀粉、小麥淀粉以及糖蜜單一碳源作為碳源，進(jìn)行碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；選擇添加量為10 g/L 蛋白胨（骨蛋白胨）、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、酵母粉、魚蛋白胨、硫酸銨、脫鹽乳清粉、酪蛋白胨以及乳清粉進(jìn)行單一氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；進(jìn)行三角瓶實(shí)驗(yàn)，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 h，進(jìn)行發(fā)酵液芽孢有效活菌計(jì)數(shù)，初步確定培養(yǎng)基成分。

在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加10 g/L 的大豆蛋白、小麥蛋白、土豆蛋白、花生蛋白、豌豆蛋白、棉籽餅粉、玉米漿粉、玉米漿液以及豆粕粉的粗料，進(jìn)行三角瓶試驗(yàn)，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 h，進(jìn)行發(fā)酵液芽孢有效活菌計(jì)數(shù)，初步確定培養(yǎng)基成分。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分比例優(yōu)化

針對(duì)上述優(yōu)化結(jié)果，選擇效果最好的碳源、氮源和粗料3 種因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）、響應(yīng)面擬合優(yōu)化分析，得到最適合添加量。

1.3.5 三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

對(duì)初始pH、接種量和培養(yǎng)溫度3 因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定克勞氏芽孢桿菌BC-G21 較優(yōu)的三角瓶培養(yǎng)條件。

1.3.6 發(fā)酵罐方法驗(yàn)證

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化確定后，進(jìn)行10 L 的小試發(fā)酵放大試驗(yàn)，接種裝有10 L 培養(yǎng)基的15 L罐中，恒溫37 ℃、攪拌180 r/min、通氣1.2 m3/h、添加0.2%消泡劑，培養(yǎng)36 h，取樣檢測(cè)發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)，驗(yàn)證優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。

1.2 數(shù)據(jù)處理

所有發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶試驗(yàn)均重復(fù)3 次，10 L 罐試驗(yàn)共重復(fù)6 次，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用WPS-2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總分析。發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分比例響應(yīng)面預(yù)測(cè)分析、方差分析利用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源為微生物生長(zhǎng)提供重要的能源和目的產(chǎn)物合成所需的碳成分，最終影響發(fā)酵活菌數(shù)和目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。多種碳源組合有利于菌體和芽孢的均衡生長(zhǎng)，但過(guò)高的碳源亦不利于芽孢桿菌的芽孢形成。不同碳源對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響如圖1 所示，由圖1 可知，在原先芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加5 g/L 的葡萄糖、玉米淀粉和麥芽糊精為碳源時(shí)，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)較高，因此以三者為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 不同碳源對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響

由表1 可知，碳源正交實(shí)驗(yàn)的極差值葡萄糖＞玉米淀粉＞麥芽糊精，最優(yōu)組合為葡萄糖15 g/L、玉米淀粉40 g/L 和麥芽糊精16 g/L。按照此優(yōu)化組合進(jìn)行碳源添加，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)最高可達(dá)9.1×108CFU/mL。

表1 克勞氏芽孢桿菌BC-G21 碳源優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

氮源可提供菌體生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中pH，同時(shí)還提供無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。氮源分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，無(wú)機(jī)氮源菌體利用速度快，發(fā)酵利用周期較短。有機(jī)氮源利用速度較慢，時(shí)效周期較長(zhǎng)，有利于芽孢桿菌發(fā)酵芽孢的形成，但來(lái)源相對(duì)不穩(wěn)定，成分復(fù)雜。所以可利用多種氮源進(jìn)行組合，減少原料帶來(lái)的影響。不同氮源（10 g/L）對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響如圖2所示，由圖2 可知，在優(yōu)化好的芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加10 g/L 的蛋白胨、大豆蛋白胨和酵母粉為氮源時(shí)，克勞氏芽孢桿菌BC-G21發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)較高，以三者為考察因素做正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 不同氮源對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響

由表2 可知，氮源正交實(shí)驗(yàn)的極差值蛋白胨＞大豆蛋白胨＞酵母粉，最優(yōu)組合為蛋白胨10 g/L、大豆蛋白胨30 g/L 和酵母粉5 g/L。按照此優(yōu)化組合進(jìn)行氮源添加，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)最高可達(dá)1.15 ×109CFU/mL。

表2 克勞氏芽孢桿菌BC-G21 氮源優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

2.1.3 粗料優(yōu)化結(jié)果

不同植物原料（如大豆、玉米、小米、豌豆和土豆等）、不同水解程度的蛋白粉或漿液體等粗料，發(fā)酵時(shí)沉降較多、成分復(fù)雜、營(yíng)養(yǎng)豐富、各種固體介質(zhì)對(duì)芽孢桿菌后期芽孢的形成有較好作用，縮短發(fā)酵后期[9-10]。不同的粗料組合有利于營(yíng)養(yǎng)平衡，減少原料來(lái)源不穩(wěn)定因素給發(fā)酵帶來(lái)的影響。不同粗料對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響如圖3 所示，由圖3 可知，在優(yōu)化好的芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加10 g/L 的小麥蛋白、土豆蛋白和大豆蛋白為粗料時(shí)，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)較高，以三者為考察因素做正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同粗料對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)的影響

由表3 可知，粗料正交實(shí)驗(yàn)的極差值土豆蛋白＞小麥蛋白＞大豆蛋白，最優(yōu)組合為土豆蛋白10 g/L、小麥蛋白15 g/L 和大豆蛋白15 g/L。按照此優(yōu)化組合進(jìn)行粗料添加，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)最高可達(dá)1.48×109CFU/mL。

表3 克勞氏芽孢桿菌BC-G21 粗料優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

2.2 響應(yīng)面效應(yīng)法優(yōu)化克勞氏芽孢桿菌BC-G21 主影響成分的比例

基于2.1 試驗(yàn)確定葡萄糖、蛋白胨和土豆蛋白為3 個(gè)最顯著因素，據(jù)此進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)。

由表4 結(jié)果可知，隨著3 個(gè)顯著因素（葡萄糖、蛋白胨和土豆蛋白）的添加量增加，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)先上升后下降，在葡萄糖添加量15 g/L、蛋白胨添加量11 g/L 和土豆蛋白添加量為13 g/L 時(shí)（第5 組），克勞氏芽孢桿菌BC-G21發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)達(dá)到最大?；诘? 組3 個(gè)顯著因素的添加量為中心點(diǎn)，以葡萄糖添加量（A）、蛋白胨添加量（B）和土豆蛋白添加量（C）為自變量，以克勞氏芽孢桿菌BC-G21 芽孢有效活菌數(shù)為響應(yīng)值（Y），利用DX-8.0 軟件設(shè)計(jì)3 因素5 水平的中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD），數(shù)據(jù)結(jié)果如表5 和表6 所示。

表4 BC-G21 培養(yǎng)基成分最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 克勞氏芽孢桿菌BC-G21 培養(yǎng)基成分CDD 設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用DE-8.0 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，模型擬合方程為Y=17.35-1.14A+0.93B-0.39C-0.31AB-0.24AC-0.24BC-2.84A2-2.34B2-1.56C2。得到的模型的決定系數(shù)是R2為0.998 8，RAdj=0.997 8，RPre=0.995 9，預(yù)測(cè)度較高。由表6 可知，模型P值＜0.0001，說(shuō)明此模型對(duì)于響應(yīng)值Y影響極顯著，可信度較高。模型的失擬項(xiàng)P值為0.765 7 ＞0.05，影響不顯著，說(shuō)明此回歸模型可信，可較好的解釋和預(yù)測(cè)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 的芽孢有效活菌數(shù)。

表6 BC-G21 培養(yǎng)基成分響應(yīng)面結(jié)果方差分析

根據(jù)擬合方程繪制出響應(yīng)面三維圖見(jiàn)圖4。由圖4 可知，土豆蛋白與葡萄糖、葡萄糖與蛋白胨、土豆蛋白與蛋白胨對(duì)克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)的交互作用顯著（P＜0.01）；在一定范圍內(nèi)，隨著土豆蛋白、葡萄糖和蛋白胨濃度的增加，克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)隨之增加；當(dāng)達(dá)到最大值后，發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)逐漸下降，進(jìn)一步說(shuō)明了3 個(gè)因素之間存在交互作用共同影響著克勞氏芽孢桿菌的芽孢數(shù)量，只有各因素在合適的添加量時(shí)，發(fā)酵液的芽孢數(shù)量才會(huì)達(dá)到最大值。

圖4 各因素交互作用對(duì)芽孢有效活菌數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線

利用響應(yīng)面優(yōu)化得到克勞氏芽孢桿菌BC-G21的最佳添加量為葡萄糖14.59 g/L、蛋白胨11.44 g/L和土豆蛋白12.75 g/L，其余的培養(yǎng)基按照優(yōu)化后的量添加。該模型預(yù)測(cè)的最大值為1.759×109CFU/mL。按照上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基量添加，37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后，發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)為1.76×109CFU/mL，可見(jiàn)該模型可較好地預(yù)測(cè)克勞氏芽孢桿菌BC-G21的發(fā)酵芽孢活菌數(shù)。

2.3 三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

由表7 可知，此試驗(yàn)的培養(yǎng)基發(fā)酵條件中3 個(gè)主要影響因素的影響順序?yàn)槠鹗紁H ＞接種量＞培養(yǎng)溫度，最優(yōu)條件為起始pH 為10.0、接種量為2%、培養(yǎng)溫度為37 ℃，在此培養(yǎng)條件下克勞氏芽孢桿菌BC-G21 發(fā)酵液芽孢活菌數(shù)為1.93×109CFU/mL。

表7 BC-G21 三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 10 L 發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，進(jìn)行10 L的小試發(fā)酵放大試驗(yàn)，接種裝有10 L培養(yǎng)基的15 L 罐中，恒溫37 ℃、攪拌180 r/min、通氣1.2 m3/h、添加0.2% 消泡劑，培養(yǎng)36 h，取樣檢測(cè)發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)，測(cè)得發(fā)酵液芽孢有效活菌數(shù)為3.88×109CFU/mL，較本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基10 L 發(fā)酵結(jié)果（4.0×108CFU/mL）提高了約10 倍。

3 結(jié)論

細(xì)菌孢子形成劑具有熱穩(wěn)定性好、生存能力強(qiáng)和通過(guò)胃屏障存活率高的特點(diǎn)，利用這些特性可將其用作人類飲食和動(dòng)物飼料中的益生菌補(bǔ)充劑[11-12]。就全球范圍來(lái)看，克勞氏芽孢桿菌（Bacillus calusii）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、蠟狀芽孢桿桿菌（Bacillus cereus）一樣，可單獨(dú)或與其他益生菌組合使用，作為兒童和成人治療腹瀉和便秘的芽孢類益生菌[13-15]。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)、中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，確定了最顯著因子的最佳添加量，為克勞氏芽孢桿菌高質(zhì)量、高密度發(fā)酵培養(yǎng)芽孢提供一定參考依據(jù)。

克勞氏芽孢桿菌BC-G21 高密度培養(yǎng)過(guò)程中最優(yōu)培養(yǎng)基為葡萄糖14.59 g/L、玉米淀粉40 g/L、麥芽糊精16 g/L、蛋白胨11.44 g/L、大豆蛋白胨30 g/L、酵母粉5 g/L、土豆蛋白12.75 g/L 、小麥蛋白15 g/L、大豆蛋白15 g/L、氯化鈉0.5 g/L、磷酸氫二鉀 0.3 g/L、氯化鈣3 g/L、七水硫酸鎂0.25 g/L、一水硫酸錳0.05 g/L；最佳培養(yǎng)條件為接種量2%，起始pH 10.0，恒溫37 ℃；利用10 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證發(fā)酵，采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行培養(yǎng)，克勞氏芽孢桿菌BC-G21的芽孢有效活菌數(shù)達(dá)到了3.88×109CFU/mL，較本實(shí)驗(yàn)室芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基10 L 發(fā)酵芽孢活菌數(shù)4.0×108CFU/mL 提高了約10 倍。合理的培養(yǎng)基及合適的培養(yǎng)條件使發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)更加均衡、營(yíng)養(yǎng)更加豐富、發(fā)酵結(jié)果更加穩(wěn)定，有利于規(guī)?；€(wěn)定性生產(chǎn)。