喻 嘉，王易明

（1. 湖南百舸水利建設股份有限公司，湖南 長沙 410007；2. 湖南百舸水利邵陽縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)污水處理項目部，湖南 邵陽 422100）

前 言

厭氧氨氧化（Anammox），是指自養(yǎng)細菌在氧氣限制條件下將氨氧化與亞硝酸鹽還原耦合產生氮氣（N2）的過程[1～2]。厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)及其在污水處理上的應用給傳統(tǒng)的廢水脫氮帶來了革命性的變化[3]。

大量研究證實了厭氧氨氧化在自然生態(tài)系統(tǒng)和人工生態(tài)系統(tǒng)中對脫氮的重要作用。過去十年的研究發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化工藝在廢水生物處理系統(tǒng)中不僅有利于去除氨氮，而且還能節(jié)約碳源和能源。目前已經開發(fā)了許多污水處理技術工藝，可以最大限度地利用厭氧氨氧化處理高濃度氨氮廢水。與傳統(tǒng)的脫氮工藝相比，厭氧氨氧化工藝具有許多優(yōu)點，例如不需要利用溶解氧從而節(jié)省能源成本， 除此之外還可以減少溫室氣體釋放，如N2O[2，4]。由于這些特點，厭氧氨氧化工藝已在實驗室模擬和實際應用中用于處理各種類型的高氮廢水，如豬場廢水、制革廢水和垃圾滲濾液等[5～7]。

厭氧氨氧化因其過程耗氧量低、對有機碳的需求量少而被廣泛應用于高濃度氨氮廢水處理[8～9]。為了維持生物廢水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定的厭氧氨氧化過程，必須提高微生物的穩(wěn)定性、多樣性和活性，為此要了解污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化微生物的群落結構及其驅動因素，因此本文采集了8 個污水處理廠的活性污泥樣品，對其厭氧氨氧化的功能基因豐度、細菌群落結構以及驅動因素進行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與環(huán)境因子測定

本文選取了8 個污水處理廠的活性污泥樣品進行分析。樣品氨氮（NH4+-N），硝氮（NO3--N）和亞硝氮（NO2--N）濃度利用流動分析儀測定。pH 值利用pH 測定儀測定?？偟═N）、總碳（TC）和總硫（TS）濃度利用元素分析儀測定。

1.2 DNA 提取與qPCR 定量

選取8 個污水處理廠的活性污泥樣品進行分析。將樣品凍干后研磨過篩，使用Mobio 試劑盒提取土壤樣品中的DNA（PowerSoil RDNA Isolation Kit，美國）。使用引物HSBeta396F（ARGGHTGGGGHAGYTGGAAG）和HSBeta 742R（GTYCCHACRTCATGVGTCTG）對厭氧氨氧化功能基因hzsB 利用熒光定量PCR 技術測定，獲得厭氧氨氧化的絕對豐度。

1.3 高通量測序與處理

利用PCR 技術從DNA 提取物中擴增出hzsB 功能基因。經過純化后在Illumina MiSeq 2500 平臺上進行高通量測序。測序得到的hzsB 序列經過質控處理后，使用QIIMEM 等軟件處理高通量序列，將處理后序列上傳至NCBI 數據庫中進行蛋白序列比對注釋，得到厭氧氨氧化細菌群落結果。

1.4 數據處理

本文中斯皮爾曼相關性分析用于處理厭氧氨氧化豐度與理化因子的相關性， 單因素方差分析用于處理不同樣品之間參數的差異性，R 和Gephi 軟件用于網絡圖的處理與分析，主坐標分析（PCOA）用于分析不同樣品間厭氧氨氧化細菌群落的相似性和差異性。

2 研究結果與討論

2.1 理化結果

對8 個污水處理廠的活性污泥樣品的理化因子進行分析，如表1 顯示，氨氮（NH4+-N）濃度在所有樣品中差異性不大（p>0.05），在20.65～31.60 mg/L 范圍內，而硝氮（NO3--N）濃度跟NH4+-N 濃度相比起來，處于較低的水平，在4.03～15.87 mg/L 范圍內；亞硝氮（NO2--N）的濃度也較低，均在1 mg/L 以下，最低為0.12 mg/L。總氮（TN）濃度在不同活性污泥樣品中變化差異性較大（p<0.05），總體濃度在0.39～4.89 g/L 范圍內，而總碳（TC）的濃度大于總氮，不同樣品間變化差異也大，最大可達73.93 g/L。pH 范圍在3.47～7.9 之間。以上結果說明，不同污水處理廠之間的活性污泥的理化性質具有差異性，這可能與各個污水處理廠污水處理的參數等有關。

2.2 厭氧氨氧化定量

針對厭氧氨氧化細菌的hzsB 功能基因對8 個污水處理廠活性污泥樣品的DNA 進行熒光定量PCR 實驗，結果顯示如圖1，厭氧氨氧化豐度變化差異性較大（p<0.05），在3.53±0.05×1010到2.51±0.01×1011copies/g VSS 范圍內。豐度范圍與其他污水處理廠相似[10，11]。E污水處理廠含有最大豐度的厭氧氨氧化豐度（2.51±0.01×1011copies/g VSS），而C 樣點含量最低（3.53±0.05×1010copies/g VSS）。斯皮爾曼相關性結果顯示，NH4+-N（p=0.002）和NO2--N（p<0.001）與豐度具有顯著正相關關系。NH4+-N 和NO2--N 作為厭氧氨氧化反應的底物，其濃度的增加必然會增加其豐度，這與以往的結果相似[10]。

圖1 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化功能基因豐度

2.3 厭氧氨氧化細菌組成和多樣性

為了了解不同污水處理廠活性污泥樣品中厭氧氨氧化細菌群落組成和變化，我們做了基于hzsB 功能基因的高通量測序技術實驗，結果共注釋到5 種厭氧氨氧化細菌種屬，分別為Candidatus Brocadia sp.a，Candidatus Brocadia sp.f，Candidatus Jettenia sp.J，Candidatus Kuenenia sp.K 和Candidatus Scalindua sp.S?？傮w來說，OTUs 數量最多的是屬于Ca.Brocadia,平均OTUs 數為69 256，顯著高于其他種屬（p<0.05）。

對厭氧氨氧化的多樣性指數進行分析，結果顯示，不同污水處理廠之間的活性污泥樣品中厭氧氨氧化細菌群落的α 多樣性指數差異性較大（p<0.05），如表2所示。與豐度結果類似，E 點的超（183.8），辛普森（0.91）和香農（3.01）指數都較大，然而多樣性最小的點是H點，表明H 污水廠內厭氧氨氧化群落的均勻度較差。相關性結果顯示，NH4+-N（p=0.002）與α 多樣性指數具有顯著正相關關系，這也說明NH4+-N 有利于增加厭氧氨氧化細菌的多樣性。

表2 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化細菌的α 多樣性指數

對厭氧氨氧化細菌群落的β 多樣性進行分析后發(fā)現(xiàn)，兩軸對細菌群落的解釋度分別為55.1%和23.4%，總體解釋度大于70%（圖2）。污水處理廠A 與D 的厭氧氨氧化細菌群落結構更為相似，而C 和B，E 和F，G和H 的群落結構更為相似，四組之間差異性較大，這可能說明污水處理廠相似的運行模式下，活性污泥中厭氧氨氧化的群落結構也會更加相似。

圖2 不同污水處理廠中活性污泥中厭氧氨氧化細菌的群落PCoA 圖

2.4 厭氧氨氧化細菌群落間相互作用

為了了解活性污泥中厭氧氨氧化群落結構的相互作用，利用網絡圖做進一步分析。選取數量占比前200的OTUs 進行網絡圖分析，保證相關性系數大于0.8 且顯著性p值小于0.05 進行分析，結果如圖3 顯示，主要分類到5 個模塊，這些模塊的節(jié)點數目占總節(jié)點的比例大于90%。總體來說厭氧氨氧化細菌群落相互作用密切，模塊化指數為0.601，而且不同模塊之間連接緊密，離散的節(jié)點數較少。整個網絡圖中Candidatus Brocadia sp. 是關鍵菌屬，與其連接的節(jié)點數達到53個，但是不同模塊中的關鍵菌屬也具有差異，例如模塊5 的關鍵菌屬是Candidatus Jettenia sp.，而模塊2 中關鍵菌屬是Candidatus Kuenenia sp.，這可能說明在活性污泥中厭氧氨氧化各個菌屬都發(fā)揮作用，但是菌種之間具有一定協(xié)同和競爭作用。以往研究對污水處理廠活性污泥絮體的研究表明，厭氧氨氧化菌多樣性較低，然而Candidatus Brocadia 是絕對優(yōu)勢物種[11]，與本文研究相似。除此之外，對處理高氨氮廢水（如垃圾滲濾液）時所用到的絮凝污泥和顆粒生物膜樣品中微生物多樣性分析表明，Candidatus Brocadia 在厭氧氨氧化菌群落中也占據主導地位[12～13]。然而在處理低氨生活廢水時，Candidatus Jettenia 和Candidatus Kuenenia 卻是優(yōu)勢物種。

圖3 不同污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化細菌群落的分子生態(tài)網絡分析

3 結 論

本文研究中選取了8 個不同污水處理廠的活性污泥樣品，研究了厭氧氨氧化的豐度、細菌多樣性、群落結構及其驅動因素，結果顯示厭氧氨氧化的豐度水平較高，可達1011copies/g VSS，且不同樣品間豐度分布差異性較大，厭氧氨氧化的多樣性變化也較大，而氨氮濃度是這些差異的主要驅動因素。氨氮與厭氧氨氧化的豐度和多樣性具有顯著正相關關系，說明高氨氮廢水更有利于富集厭氧氨氧化。除此之外，厭氧氨氧化細菌的群落相互作用較為密切，且Candidatus Brocadia 是優(yōu)勢菌屬，主導厭氧氨氧化反應過程。以上結果多方面研究了不同污水處理廠活性污泥中厭氧氨氧化細菌賦存現(xiàn)狀和其影響因素，對提高厭氧氨氧化微生物在污水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性、多樣性和活性具有參考意義。