劉曉霞，丁青，陳芳，梁月儀，魏梅，孫冬梅，田維忠，霍文杰，李振雨*（1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244；.中國(guó)中藥控股有限公司，廣東 佛山 5280）

中藥配方顆粒作為臨床飲片的補(bǔ)充，具有安全、衛(wèi)生、便于隨身攜帶、方便調(diào)劑使用等優(yōu)勢(shì)，是中藥飲片劑型改革的主要方向[1]。截止目前中藥配方顆粒尚沒有正式出臺(tái)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，因此，市場(chǎng)流通的中藥配方顆粒規(guī)格不統(tǒng)一，質(zhì)量的參差不齊導(dǎo)致臨床使用療效難以保證，也為市場(chǎng)監(jiān)管帶來(lái)一定難度。

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥葉[2]，是臨床常用的補(bǔ)陽(yáng)藥?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究表明，淫羊藿含有黃酮、酚苷、多糖和生物堿等多種有效成分，其中代表性的有效成分有淫羊藿苷，朝藿定A、B、C，寶藿苷Ⅰ等[3]，具有一定的骨細(xì)胞誘導(dǎo)潛能[4]，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖[5]，抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)、阻止骨細(xì)胞鈣化的功能[6]。由于中藥有效成分的多樣性及復(fù)雜性，單一成分定量的化學(xué)藥品質(zhì)量控制模式既缺乏專屬性，又難以反映中藥內(nèi)在質(zhì)量，中藥指紋/特征圖譜能夠提供更為全面、豐富的信息，因此常用于中藥的質(zhì)量控制研究。一測(cè)多評(píng)模式借助相對(duì)校正因子，只需測(cè)定一個(gè)成分（內(nèi)參物），實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)有效成分的定量分析，解決了對(duì)照品難以獲得的難題，在中藥的質(zhì)量控制方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛[7-9]。本研究將淫羊藿配方顆粒特征圖譜與一測(cè)多評(píng)模式相結(jié)合，從定性定量?jī)蓚€(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)淫羊藿配方顆粒的質(zhì)量，為淫羊藿配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（e2695，沃特世公司），Thermo 高效液相色譜儀（U3000，賽默飛公司），Agilent 高效液相色譜儀（1260，安捷倫公司），Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（安捷倫公司），Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（賽默飛公司），Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（沃特世公司），萬(wàn)分之一分析電子天平（ME204E）、百萬(wàn)分之一分析電子天平（XP26，梅特勒-托利多公司），電子天平（JJ600，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），數(shù)控超聲波清洗器（KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司），恒溫水浴鍋（HWS28型，上海一恒科技有限公司），超純水系統(tǒng)（Milli-Q Direct，默克股份有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（默克股份有限公司，色譜純），水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其余試劑皆為分析純。朝藿定A 對(duì)照品（批號(hào)：150520，含量：99.4%）、朝藿定B 對(duì)照品（批號(hào)：150518，含量：99.24%）（成都普菲德生物股份有限公司）；朝藿定C 對(duì)照品（批號(hào)：111780-201503，含量：100%）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-201516，含量：94.2%）、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：111852-201603，含量：99.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；12 批淫羊藿配方顆粒[廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：YYH01～YYH12，規(guī)格：0.5 g/袋（相當(dāng)于常規(guī)飲片10 g）]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～30 min，24%～26%A；30～31 min，26%～45%A；31～45 min，45%～47%A）；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定朝藿定A、B、C 對(duì)照品和淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含朝藿定A 17.201 μg、朝藿定B 36.938 μg、朝藿定C 48.270 μg、淫羊藿苷99.890 μg 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取淫羊藿配方顆粒樣品適量，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取淫羊藿配方顆粒（批號(hào)：YYH11）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以淫羊藿苷色譜峰為參照峰S，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均不超過0.7%，相對(duì)峰面積RSD值均不超過0.11%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批淫羊藿配方顆粒（批號(hào)：YYH11），按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以淫羊藿苷色譜峰為參照峰S，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均不超過0.12%，相對(duì)峰面積RSD值均不超過0.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取淫羊藿配方顆粒（批號(hào)：YYH11）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、14、19 和24 h 進(jìn)樣測(cè)定，以淫羊藿苷峰為參照峰S，計(jì)算其余特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均不超過0.18%，相對(duì)峰面積RSD值均不超過0.29%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 淫羊藿配方顆粒特征圖譜的建立

取12 批淫羊藿配方顆粒供試品溶液（批號(hào)：YYH01～YYH12），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各批次樣品的特征圖譜，并導(dǎo)出CDF格式，將12 批淫羊藿配方顆粒特征圖譜CDF 格式導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以YYH01 的特征圖譜為參照，對(duì)12 批淫羊藿配方顆粒特征圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)識(shí)，并進(jìn)行保留時(shí)間校正和峰匹配（見圖1），選擇出峰穩(wěn)定，峰形和分離度較好的7 個(gè)共有峰作為淫羊藿配方顆粒的特征峰，建立淫羊藿配方顆粒特征圖譜共有模式（見圖2），參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，通過對(duì)照品的保留時(shí)間比對(duì)并結(jié)合3D 光譜分析確定峰2 為朝藿定A，峰3 為朝藿定B，峰4 為朝藿定C，峰5 為淫羊藿苷，峰7 為寶藿苷Ⅰ，見圖3。以淫羊藿配方顆粒特征圖譜共有模式為參照，計(jì)算各樣品特征圖譜的相似度均大于0.9（見表1），說(shuō)明12 批淫羊藿配方顆粒特征圖譜的整體相似度較高，質(zhì)量較穩(wěn)定。

表1 12 批淫羊藿配方顆粒特征圖譜相似度Tab 1 Similarity of specific chromatogram of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules

圖1 12 批淫羊藿配方顆粒HPLC 特征圖譜Fig 1 HPLC specific chromatogram of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules

圖2 淫羊藿配方顆粒HPLC 特征圖譜共有模式Fig 2 Common pattern of HPLC specific chromatograms of Herba epimedii dispensing granules

圖3 淫羊藿配方顆粒特征圖譜Fig 3 Chromatogram of Herba epimedii dispensing granules

2.6 總黃酮醇苷一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密稱定對(duì)照品朝藿定A 4.883 mg、朝藿定B 4.643 mg、朝藿定C 10.001 mg、淫羊藿苷10.573 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含朝藿定A 485.370 μg、朝藿定B 460.771 μg、朝藿定C 1000.100 μg、淫羊藿苷995.977 μg 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.5、0.5、1、2、3 mL，分別置100、25、5、5、5、5 mL 的量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液液，精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液和系列濃度的混合對(duì)照品溶液各10 μL，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以色譜峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），相應(yīng)的對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及線性范圍見表2。

表2 4 種成分的線性回歸方程及線性范圍Tab 2 Linear regression equation and linearity of 4 components

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的峰面積RSD值分別為1.1%、0.33%、0.41%和0.39%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、3、6、14、19、24 h 測(cè)定，結(jié)果朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的峰面積RSD值分別為0.51%、0.30%、0.37%和0.33%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取淫羊藿配方顆粒供試品（批號(hào)：YYH02）溶液6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以干燥品計(jì)，朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的含量分別為6.76、14.00、18.73、37.95 mg·g－1，RSD值分別為1.5%、0.81%、0.93%和0.69%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 取淫羊藿配方顆粒（批號(hào)：YYH02）適量，研細(xì)，取約0.125 g，精密稱定，按樣品與對(duì)照品（朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷）的含量比為1∶0.5、1∶1 及1∶1.5 的比例加入朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷對(duì)照品，每種比例平行3 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備9 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果朝藿定A、B、C 及淫羊藿苷的加樣回收率分別在95.84%～99.78%、95.49%～101.62%、95.17%～101.41%、95.07%～99.92%，RSD值均小于2.0%，表明該分析方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.6 相對(duì)校正因子計(jì)算 根據(jù)“2.6.1”項(xiàng)下線性考察結(jié)果，以對(duì)照品的濃度及其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積，計(jì)算內(nèi)標(biāo)物淫羊藿苷與朝藿定A、B、C的相對(duì)校正因子[11]。朝藿定A、B、C 的平均相對(duì)校正因子分別為1.35、1.26 和1.24，RSD值分別為0.43%、1.1%和1.2%。

2.6.7 耐用性考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別考察Waters ARC、ThermoU3000、Agilent 1260 infinity 3 種高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 種不同色譜柱，以及不同柱溫和流速對(duì)朝藿定A、B、C 的相對(duì)校正因子以及各色譜峰分離度的影響。結(jié)果表明，不同色譜儀、色譜柱、柱溫及流速下測(cè)定的朝藿定A、B、C 的相對(duì)校正因子RSD值均小于2.0%，且各色譜峰的分離度均大于1.5，表明該方法耐用性較好。

2.6.8 色譜峰定位 根據(jù)“2.6.7”項(xiàng)下耐用性考察結(jié)果，以淫羊藿苷峰為參照峰，分別計(jì)算Waters ARC、Thermo U3000、Agilent 1260 infinity 3 種高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 種不同色譜柱，以及不同柱溫和流速對(duì)朝藿定A、B、C 相對(duì)于參照峰的相對(duì)保留時(shí)間值。結(jié)果顯示，不同的儀器、色譜柱、柱溫和流速對(duì)朝藿定A、B、C 的相對(duì)保留時(shí)間影響較小，RSD均小于5.0%，因此，可以采用相對(duì)保留時(shí)間作為色譜峰定位的依據(jù)，朝藿定A、B、C 的相對(duì)保留時(shí)間值取不同儀器、色譜柱、柱溫和流速下相對(duì)保留時(shí)間的均值，分別是0.71、0.79 和0.88。

2.6.9 QAMS 與EMS 比較 取12 批淫羊藿配方顆粒樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS 計(jì)算12 批淫羊藿配方顆粒中朝藿定A、B、C 的含量，并計(jì)算兩種測(cè)定法的相對(duì)平均偏差（RAD）（見表3），結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定的朝藿定A、B、C 的RAD 均小于1.0%，說(shuō)明兩種方法計(jì)算結(jié)果一致，一測(cè)多評(píng)法能準(zhǔn)確測(cè)定4 種成分的含量。12 批淫羊藿配方顆粒淫羊藿苷的含量均大于20 mg·g－1，12 批淫羊藿配方顆?？傸S酮醇苷的含量在46.73～88.94 mg·g－1。

表3 12 批淫羊藿配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果(以干燥品計(jì)，mg·g－1)Tab 3 Determination of 12 batches of Herba epimedii dispensing granules (mg·g－1)

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

以“特征圖譜總峰面積/稱樣量”及總黃酮醇苷的含量為指標(biāo)，系統(tǒng)考察了提取溶劑（不同比例的甲醇-水、乙醇-水、甲醇和乙醇）、提取方式（超聲和回流兩種不同方式）和提取時(shí)間（15、30、45、60 min）對(duì)淫羊藿配方顆粒特征圖譜及含量測(cè)定的影響，結(jié)果顯示，以75%乙醇50 mL超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min 效果最佳。

3.2 特征圖譜和一測(cè)多評(píng)研究

對(duì)12 批淫羊藿配方顆粒特征圖譜研究，確定了7 個(gè)共有特征峰，指認(rèn)了其中5 個(gè)，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間一致性較好，相對(duì)峰面積差異較大，但指紋圖譜的整體，相似度較高，都大于0.9。含量測(cè)定結(jié)果顯示，4 種成分的含量在不同批次樣品間相差較大，可能與原料的來(lái)源和生產(chǎn)工藝的不同有關(guān)；外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法所得結(jié)果無(wú)明顯差異，表明本研究建立的一測(cè)多評(píng)法能夠代替外標(biāo)法對(duì)淫羊藿配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制。

4 小結(jié)

中藥化學(xué)成分繁多，單一成分難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)配方顆粒的質(zhì)量，一測(cè)多評(píng)法是多指標(biāo)質(zhì)量控制方法之一，將一測(cè)多評(píng)法與指紋/特征圖譜法相結(jié)合，從定性、定量?jī)蓚€(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)淫羊藿配方顆粒的質(zhì)量，該方法快速準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便高效，專屬性良好，為淫羊藿配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。