◎ 吳家玲，龔曉瑩，陳曉嘉，麥慧甜

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

黑木耳又名黑菜，屬于層菌綱木耳科，可藥食兩用[1]。黑木耳具有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)及8種人體必需的氨基酸，還含有多種糖類、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[2]。黑木耳富含多種活性成分，如膠原、多糖、木耳黑色素、卵磷脂、植物堿和發(fā)酵素等[1]。其中，多糖是黑木耳的主要活性成分[3-4]，具有預(yù)防高血壓、高血脂、冠心病、抗血栓及抗衰老等作用[5]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品中。

多糖在植物、動物與微生物體內(nèi)廣泛存在，是天然高分子中的一大類。目前，食品中多糖的測定方法主要是堿性酒石酸銅滴定法和比色法（苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法）兩種。一般來說，比色法優(yōu)點是靈敏度高（可達(dá)μg·mL-1，滴定法為mg·mL-1），樣品用量少；缺點是做常規(guī)測定時用葡萄糖作為對照品，誤差較大。其中，苯酚-硫酸分光法是粗多糖測定最常用的方法，其原理是多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，再與苯酚-硫酸作用生成橙紅色化合物，其呈色強度與溶液中糖的濃度成正比[6]。

本文使用苯酚-硫酸法測定黑木耳中粗多糖含量，針對黑木耳中粗多糖進(jìn)行檢測前處理條件優(yōu)化的研究，分別對樣品水浴時間、乙醇濃度、離心速度、乙醇洗滌次數(shù)4個前處理條件進(jìn)行單因素試驗，并采取4因素4水平正交試驗進(jìn)行條件優(yōu)化，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，得出合理穩(wěn)定的檢測前處理條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售黑木耳，葡萄糖（99.9%，Aladdin公司），無水乙醇、硫酸和苯酚均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E/02型電子天平，METTLER TOLEDO；EX125DZH型電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；HWS-26型水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE型超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；3K15型離心機，北京博勵行儀器有限公司；T9型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工作曲線繪制

稱取0.100 0 g葡萄糖于1 L容量瓶中加水溶解并定容，即得到濃度為100 mg·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[6]。

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水補至1.0 mL。向試液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將比色管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，于490 nm處測吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程由紫外分光光度計自帶軟件UVWin6.1軟件得出，回歸方程為y=91.583 75x+1.800 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.3.2 樣品前處理

將準(zhǔn)備好的樣品置于200 mL容量瓶中，加蒸餾水100 mL左右，沸水浴回流提取1 h，冷卻至室溫后補水至刻度，混勻后過濾，棄去初濾液，收集剩余濾液供沉淀粗多糖。取樣液5 mL加入20 mL無水乙醇，同時使用渦旋振蕩器振搖，超聲提取30 min[7]。提取結(jié)束后，于4 000 r·min-1條件下離心10 min，棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用蒸餾水將上述不溶物轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并搖勻，取1 mL樣品溶液于25 mL比色管中，并做空白試驗，樣品和空白與標(biāo)曲顯色步驟一致，最后比色并代入回歸方程進(jìn)行計算[6]。

1.3.3 粗多糖的含量計算

按照式（1）計算黑木耳中粗多糖的含量：

式（1）中：X-試樣中粗多糖的含量，g/100 g；C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測液中試樣中粗多糖的質(zhì)量，μg；m-試 樣 質(zhì) 量，g；V1-試 樣 定 容 體 積，mL；V2-試樣提取體積，mL；V3-提取總多糖后定容體積，mL；V4-測定用試樣體積，mL；0.9-葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

分別對水浴時間（1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h）、乙醇濃度（75%、80%、85%和90%）、離心速度（5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1）、洗滌次數(shù)（2次、3次、4和5次）4種處理條件進(jìn)行單因素試驗。

1.3.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，進(jìn)行正交試驗，以粗多糖提取率來確定黑木粗中粗多糖檢測前處理最佳條件組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴時間對檢測結(jié)果的影響

分別水浴1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h進(jìn)行試驗，分析水浴時間對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2看出，水浴時間對粗多糖的檢測結(jié)果影響明顯，水浴時間延長粗多糖含量呈先遞增后趨于平穩(wěn)的趨勢。在1.5～2.0 h粗多糖提取率增加趨勢明顯，2.0～3.0 h趨于平穩(wěn)，3.0 h提取率達(dá)到最高。由此得出，粗多糖溶出率隨水浴時間延長而提高。

圖2 不同水浴時間對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

2.2 乙醇濃度對檢測結(jié)果的影響

分別使用75%、80%、85%和90%的乙醇濃度進(jìn)行試驗，分析乙醇濃度對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可得出，隨著乙醇濃度的提高，檢測得到的粗多糖含量呈先遞增后遞減的規(guī)律，當(dāng)乙醇濃度從75%提高至85%時檢測得到的粗多糖含量逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度由85%提高至90%時檢測含量出現(xiàn)下降。由此得出乙醇濃度85%時黑木耳粗多糖沉淀更完全。

圖3 不同乙醇濃度對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

2.3 離心速度對檢測結(jié)果的影響

分別使用5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1的離心速度進(jìn)行試驗，分析離心速度對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可得出，在離心速度為5 000～8 000 r·min-1時，檢測得到的粗多糖含量呈先遞增后趨于平穩(wěn)的規(guī)律。在離心速度為5 000～6 000 r·min-1時，檢測結(jié)果上升較慢；在6 000～7 000 r·min-1時，檢測結(jié)果增速比較快；在離心速度為7 000～8 000 r·min-1時，檢測得到的粗多糖含量呈趨于平穩(wěn)的規(guī)律。由此得出，離心速度達(dá)到7000 r·min-1及以上時粗多糖沉淀較為完全。

圖4 不同離心速度對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

2.4 乙醇洗滌次數(shù)對檢測結(jié)果的影響

分別按照2、3、4和5次的洗滌次數(shù)進(jìn)行試驗，分析乙醇洗滌次數(shù)對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5可得出，洗滌次數(shù)由2次增加到3次時，檢測得到的粗多糖含量快速降低；洗滌次數(shù)為3次和4次時，檢測結(jié)果差別不大；在洗滌次數(shù)達(dá)到5次時，檢測結(jié)果再次出現(xiàn)微量下降。由此得到，乙醇洗滌次數(shù)的增加會導(dǎo)致黑木耳粗多糖檢測含量的降低。

圖5 不同乙醇洗滌次數(shù)對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

2.5 正交試驗結(jié)果

根據(jù)4因素4水平正交實驗L16（44）的試驗結(jié)果，以“測定值與平均值相對偏差”為指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲取最佳實驗條件組合，結(jié)果見表1。

根據(jù)表1中4個因素的極差值R可知，對實驗結(jié)果影響最大的前處理是水浴時間，次之是乙醇濃度，再之是乙醇洗滌次數(shù)，離心速度是影響最小的條件。

表1 L16（44）正交實驗分析表

根據(jù)表中K1～K4與平均值的相對偏差分析得出，最佳實驗條件組合為A2B2C3D3，即檢測前處理條件為水浴時間2 h、乙醇濃度80%、離心速度7 000 r·min-1、乙醇洗滌次數(shù)4次。

3 結(jié)論

根據(jù)正交實驗分析得出：在4個因素中，對實驗結(jié)果影響最大的前處理是水浴時間，次之是乙醇濃度，再之是乙醇洗滌次數(shù)，而離心速度是影響最小的條件；其最佳實驗條件組合為水浴時間2 h、乙醇濃度80%、離心速度7 000 r·min-1、乙醇洗滌次數(shù)4次。