(北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100176)

回收實(shí)驗(yàn)是一種“對(duì)照性實(shí)驗(yàn)”，向基質(zhì)復(fù)雜、組分不完全清楚的樣品中定量加入已知組分，測(cè)定該組分含量與加入量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)，即為回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果用于判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程存在的系統(tǒng)誤差，進(jìn)而判定分析方法的正確性。通?；厥章试?00%±5%之間，說(shuō)明系統(tǒng)誤差可控，符合方法學(xué)的合格要求；在100%±(6%～10%)之間，說(shuō)明系統(tǒng)誤差可接受，但是不完全滿足方法學(xué)的要求，需要進(jìn)一步優(yōu)化；當(dāng)回收率超過(guò)100%±10%時(shí)，說(shuō)明系統(tǒng)誤差過(guò)大，不符合方法學(xué)要求，方法不成立?；厥章史秶矔?huì)根據(jù)被測(cè)物含量以及復(fù)雜程度有所變化。實(shí)際上，影響回收率的因素很多，本文從易被忽略但是影響較大的環(huán)境因素、添加物的選擇及用量、回收率的計(jì)算三方面加以討論。

1 環(huán)境條件

實(shí)驗(yàn)會(huì)受溫度、干濕度等環(huán)境因素的影響，其波動(dòng)會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的變化。如：夏天在沒(méi)有溫控的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)定碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，標(biāo)定結(jié)果和方法誤差很難達(dá)到要求。有些特定的實(shí)驗(yàn)即使在恒溫操作環(huán)境中，溫度、干濕度的波動(dòng)也可會(huì)影響標(biāo)定結(jié)果。如：工作曲線法測(cè)定苯系物，需要將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品、溶劑、微量注射器等在相同溫度下平衡，即溫度控制完全一致；操作過(guò)程中空氣流量及均勻性也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。在實(shí)際操作中，環(huán)境條件受到客觀制約較大，相對(duì)難以控制，也是主觀上經(jīng)常被忽略的影響因素。對(duì)于受環(huán)境影響較小的實(shí)驗(yàn)，回收率實(shí)驗(yàn)基本能夠達(dá)到要求。但對(duì)于氣體、揮發(fā)性液體、需要冷藏物品、溫度敏感性反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)，必須考慮環(huán)境因素的影響，否則回收率結(jié)果可能導(dǎo)致結(jié)論不具有說(shuō)服力。因此，根據(jù)具體情況控制環(huán)境因素是確保回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠的重要前提。

2 添加物質(zhì)的選擇及用量

添加物質(zhì)和被測(cè)樣品的差異性是決定回收率實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，其中二者基體的一致性程度最為重要。當(dāng)二者基體完全一致時(shí)，分離、提取、濃縮、檢測(cè)各環(huán)節(jié)不存在相互干擾，回收率應(yīng)該為100%。實(shí)際上，二者完全一致的情況較難遇到，大多數(shù)情況都是二者一致性程度不高，需要通過(guò)回收率實(shí)驗(yàn)證明分離、提取、濃縮、檢測(cè)各環(huán)節(jié)間的不會(huì)互相影響，滿足方法學(xué)要求。

2.1 添加物質(zhì)的選擇

最理想的添加物質(zhì)是基體與樣品完全一致的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或基體接近(類似)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國(guó)家認(rèn)可的能力驗(yàn)證機(jī)構(gòu)提供的“指定值”物質(zhì)(質(zhì)控樣品)次之。實(shí)際上，空白基質(zhì)(除沒(méi)有被測(cè)組分外其他與樣品完全一致)比較難獲得，大部分時(shí)候都不能滿足上述兩種情況，此時(shí)采用將添加物質(zhì)直接加入被測(cè)樣品的方法考察回收率。

2.2 添加量的選擇

添加量一般選擇多點(diǎn)法，以3或5種添加量為宜，即三水平或五水平添加。實(shí)際操作時(shí)，考慮到時(shí)間成本，選擇1點(diǎn)或2點(diǎn)進(jìn)行添加，回收率結(jié)果的說(shuō)服力有限。添加量最重要指標(biāo)是當(dāng)加入2倍被檢含量時(shí)，回收率依然滿足方法學(xué)要求。

3 回收率的計(jì)算

以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B6的測(cè)定(GB 5009.154-2016)》中第一法液相色譜法為例，對(duì)回收率的計(jì)算方法進(jìn)行說(shuō)明。標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，樣品經(jīng)過(guò)提取等前處理后，經(jīng)C18色譜柱分離，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量微生物B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)的含量。

3.1 絕對(duì)回收率

添加標(biāo)準(zhǔn)樣品的量為(A)，檢測(cè)并計(jì)算得到的量(B)，二者的比值乘以100%，得到絕對(duì)回收率。如果有基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者質(zhì)控樣品，通過(guò)絕對(duì)回收率可以同時(shí)完成前處理方法適用性和基質(zhì)干擾的考察；如果沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者質(zhì)控樣品，則需要對(duì)二者分別進(jìn)行考察。

公式(1)

式中：A為標(biāo)準(zhǔn)樣品添加量；B為測(cè)定的量。

3.1.1考察前處理方法的適用性

利用絕對(duì)回收率主考察樣品前處理方法的適用性，即是前處理方法的系統(tǒng)性誤差。將已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品按照前處理方法進(jìn)行處理后進(jìn)行測(cè)定，并按照公式(1)計(jì)算得到絕對(duì)回收率。具體到食品中維生素B6的測(cè)定，將3.4.4(GB5009.154-2016，下同)中的維生素B6混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照需要稀釋后，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；按照5.1的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備進(jìn)行前處理操作，按照5.4的要求進(jìn)行測(cè)定后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量為3種物質(zhì)的含量分別為B1、B2和B3；分別將上述數(shù)據(jù)代入公式(1)，計(jì)算得到回收率。該數(shù)據(jù)反應(yīng)了前處理方法對(duì)該樣品中吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的適用性。

3.1.2考察基質(zhì)的干擾影響

利用絕對(duì)回收率主考察樣品基質(zhì)的影響，將標(biāo)準(zhǔn)樣品加到空白基質(zhì)中檢測(cè)并按照公式(1)計(jì)算得到絕對(duì)回收率。具體到食品中維生素B6的測(cè)定，將3.4.4中的維生素B6混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照需要稀釋后，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；加入不含有吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的該食品中，按照5.4的要求進(jìn)行測(cè)定后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量為3種物質(zhì)的含量分別為B1、B2和B3；分別將上述數(shù)據(jù)代入公式(1)，計(jì)算得到回收率。該數(shù)據(jù)反應(yīng)了樣品基質(zhì)對(duì)樣品中吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺檢測(cè)結(jié)果的影響。

3.2 相對(duì)回收率

沒(méi)有基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者質(zhì)控樣品時(shí)候，可以用相對(duì)回收率考察檢測(cè)方法的適用性。向樣品(A)中加入不同含量(B)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)前處理后，測(cè)定總含量(C)。計(jì)算方法為從C中扣除樣品中的含量(A)，與加入量(B)的比值乘以100%，得到相對(duì)回收率。

公式(2)

式中：A為樣品中目標(biāo)物的含量(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到)；

B為已知加入量；C為檢測(cè)得到的總含量(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到)。

具體到食品中維生素B6的測(cè)定，操作如下：樣品按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行前處理，測(cè)定得到吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的含量分別為A1、A2和A3；分別取3.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的中的低、中、高3個(gè)濃度(B1、B2和B3)的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入相應(yīng)的樣品中(以一個(gè)濃度為例)；按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前處理3種物質(zhì)的含量分別為C1、C2和C3；分別將上述數(shù)據(jù)代入公式(2)，計(jì)算得到回收率，該數(shù)值反應(yīng)了檢測(cè)方法在不同水平下檢測(cè)方法的適用性。

此外，回收率實(shí)驗(yàn)一般需要做3、5、7次，以其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示該數(shù)據(jù)和真值的偏離程度。