段冰霞，陳宏慈, 徐安，蕭閔，田代志

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)：1中醫(yī)臨床學(xué)院,3中醫(yī)藥實驗中心，武漢 430065；2湖北省中醫(yī)院老年病科，武漢 430061)

胃內(nèi)容物反流入食管產(chǎn)生癥狀或并發(fā)癥時，稱胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)，酸(堿)反流導(dǎo)致的食管黏膜破損稱反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)[1]。GERD在全世界普遍存在，其患病率不斷升高，且疾病負擔(dān)正在增加[2]。西醫(yī)認(rèn)為GERD是食管下括約肌(lower esophageal sphincter,LES)松弛、胃酸反流、黏膜屏障受損等原因所致, 治療以抑酸、促胃腸動力為主[3]。治療藥物以質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor,PPI)、H2受體阻滯劑、促胃腸動力藥等為主，雖然有療效，但容易復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥治療RE有一定的特色和優(yōu)勢。食管寧為臨床治療RE過程中總結(jié)出的經(jīng)驗方，臨床療效佳。本實驗以食管寧經(jīng)驗方為基礎(chǔ)，觀察其對RE大鼠胃動素(motilin,MTL)、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA的影響，探討食管寧治療RE的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購自三峽大學(xué)，合格證號：SCXK(鄂)2017-0012，按隨機數(shù)表法分為5組：假手術(shù)組(sham組)、模型組(M組)、食管寧高劑量組(H組)、食管寧低劑量組(L組)和西藥組(W組)，每組12只；飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，每日光照時間12 h，溫度(25±1)℃，相對濕度45%～60%。自由進食飲水。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 實驗試劑及儀器

基因美大鼠胃動素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號：JYM0376Ra)；CFX96實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD, 美國伯樂公司)、EDC-810型PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、Bx-60型olympus光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。全自動圖象分析儀：01ymPusBX-50顯微攝影系統(tǒng)、PalardoDMCI數(shù)碼相機、HUMAIS-2000醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 實驗藥物

食管寧由北沙參、桔梗、炙杷葉、柴胡、香櫞皮、全瓜蔞、枳實、厚樸、蘇梗、郁金、香附、牛膝構(gòu)成，經(jīng)湖北省中醫(yī)院藥劑科煎煮、濃縮、消毒，制備成分別含1，2 g/ml生藥的濃縮湯劑。于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

埃索美拉唑鎂腸溶片20 mg/片，給藥前稀釋為0.24 mg/ml的混懸液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前均先常溫放? h。

1.4 造模方法

術(shù)前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛腹腔注射(3 ml/kg)麻醉，行常規(guī)備皮(2 cm×2 cm范圍)及消毒鋪巾，手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作。

M組、H組、L組和W組行“不全幽門結(jié)扎+食管下括約肌切開術(shù)”[4]，于食管-胃交界右前壁處做一長約0.5 cm縱行切口，同時避開血管和神經(jīng)，完全切開胃食管交界區(qū)平滑肌，使胃黏膜及食管黏膜充分外露，分離至黏膜層完全暴露于視野中，分離前用血管鉗夾住胃-食管交界處的胃左動脈分支，后外置幽門部分結(jié)扎，將直徑為4 mm的金屬棒放置胃幽門處外側(cè)，將金屬棒連同幽門一并結(jié)扎，并避開血管，結(jié)扎完畢后，將金屬棒抽出后關(guān)腹。sham組只行開腹后暴露食管-胃交界處，夾住胃左動脈分支約10 min后關(guān)腹。

關(guān)腹前每只大鼠腹腔內(nèi)注入硫酸慶大霉素2萬U，創(chuàng)口予以碘伏消毒。術(shù)后可飲5%葡萄糖氯化鈉溶液，禁食24 h。

1.5 實驗步驟

常規(guī)喂養(yǎng)1周后，參考黃繼汗等藥物等效劑量換算標(biāo)準(zhǔn)[5]。M組、sham組予0.9%氯化鈉溶液；H組和L組分別予食管寧湯劑2，1 g/ml；W組予埃索美拉唑鎂腸溶片混懸液0.24 mg/ml。每次1.5 ml/100 g，均灌胃，1次/d，共2周。

1.6 取材

2周后，實驗大鼠均予10%水合氯醛腹腔注射(3 ml/kg)麻醉，行常規(guī)備皮(2 cm×2 cm范圍)及消毒鋪巾。抽取腹主動脈血液5 ml，并離心(2000～3000 轉(zhuǎn)/min，20 min，2 ℃～8 ℃)取上清液。自胃食管交界上0.5 cm處向咽喉部截取1 cm食管組織，分為3部分，一部分置于4 ℃ 4%多聚甲醛中保存，余2部分儲存于-80 ℃冰箱。

1.7 觀察指標(biāo)和方法

1.7.1 大鼠一般狀態(tài) 觀察各組實驗大鼠一般狀態(tài)，如毛發(fā)色澤及脫落、活躍，進食水量、大便量及性狀、體質(zhì)量等。

1.7.2 食管黏膜病理學(xué)觀察 食管組織經(jīng)4 ℃ 4%多聚甲醛常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，每個標(biāo)本4張(厚度約5 μm)，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察大鼠食管黏膜組織切片并進行RE病理分級，正常、輕度、中度、重度按照0、1、2、3計分。食管黏膜組織病理分級采用中華醫(yī)學(xué)會消化內(nèi)鏡分會(2003年)的RE診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.7.3 血漿胃動素含量測定 離心血漿按基因美大鼠MTL試劑盒使用說明書檢測步驟逐步進行。

1.7.4 食管組織IL-17和TNF-α mRNA的表達 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測食管組織IL-17 和TNF-α mRNA的表達。Trizol法提取RNA，并將總RNA置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?；逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，10倍稀釋，行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec，60 °C 30 sec，40圈。行溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 異常情況

因術(shù)后胃腸脹氣，sham組、H組、L組和W組各剔除1只。因食物反流明顯入肺窒息死亡，H組剔除1只，M組剔除2只。

2.2 一般情況

造模及灌胃期間，5組均有不同程度的毛發(fā)色澤變暗、活動減少、進食水量下降、稀水樣便、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。其中sham組上述表現(xiàn)恢復(fù)最快，M組恢復(fù)最慢，且上述表現(xiàn)最明顯。

2.3 各組RE大鼠病理積分、血漿胃動素、食管組織IL-17 mRNA及TNF-α mRNA的比較

光鏡下發(fā)現(xiàn)，sham組實驗大鼠的食管黏膜組織切片無明顯炎性改變，偶見上皮細胞層內(nèi)少許炎癥細胞。其余實驗大鼠均見基底層、棘層鱗狀上皮不同程度增生，鱗狀上皮基底細胞可見細胞核增大，染色質(zhì)增粗，固有層乳頭延伸。M組大鼠黏膜固有層可見明顯中性粒細胞浸潤，甚至可見潰瘍灶。與M組相比較，H組、L組和W組3組實驗大鼠的炎癥改變均較輕，均未見明顯潰瘍灶，或僅見上皮細胞層內(nèi)炎癥細胞浸潤(圖1)。

圖1 大鼠食管黏膜組織切片蘇木精-伊紅染色

實驗大鼠食管黏膜組織切片病理分級積分分析發(fā)現(xiàn)，sham組積分最低，與M組、H組和L組3組進行比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，sham組與W組比較無差異(P>0.05)。M組積分最高，與H組、L組和W組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。M組血漿MTL含量最低，與sham組、H組、L組和W組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。sham組IL-7 mRNA表達量最低。M組IL-7 mRNA表達量最高，與sham組、H組、L組和W組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。H組與其余4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Sham組TNF-α mRNA表達量最低。M組TNF-α mRNA表達量最高，與sham組、H組、L組、W組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 病理積分、血漿胃動素、食管組織IL-17 mRNA及TNF-α mRNA結(jié)果比較

3 討 論

在中醫(yī)領(lǐng)域，RE根據(jù)癥狀多歸屬于食管癉、噎膈、反胃、嘈雜和痞滿等疾病范疇。RE的病位在食管和胃，與脾、肝、膽、肺密切相關(guān)?；静C為胃失和降，胃氣上逆?！胺A賦不足、脾胃虛弱”為RE的發(fā)病基礎(chǔ)。RE以疏暢氣機為要。臨床多見肝郁之象，因而常以疏肝和胃降逆為治療大法。食管寧經(jīng)驗方根據(jù)中醫(yī)氣機升降理論，結(jié)合RE多氣虛氣郁的致病特點總結(jié)得出。該方不僅補虛，還宣上(宣肺氣)、暢中(疏肝氣、降胃氣)、通下(引熱下行、潤腸通便)，調(diào)理全身氣機升降。方中北沙參益氣養(yǎng)陰；桔梗、炙杷葉宣通肺氣；柴胡、香櫞皮疏肝行氣，以治肝安胃，從而調(diào)理脾胃氣機；瓜蔞、枳實、厚樸寬中下氣，疏通腸道氣機；全方調(diào)理全身氣機使之通暢，以治療RE。

PPI為治療RE首選藥物，多項研究表明埃索美拉唑鎂腸溶片治療RE療效確切[6-8]。本研究H組和L組食管黏膜組織病理積分較M組低，與W組比較無顯著差異；說明食管寧能明顯改善RE大鼠食管黏膜損傷，且與埃索美拉唑鎂腸溶片療效相當(dāng)。

食管下括約肌壓力(lower esophageal sphincter pressure,LESP)降低為導(dǎo)致GRED重要原因；LESP越低，反流越嚴(yán)重[9]。MTL為小腸Mo細胞分泌的胃腸道肽激素，可作用于LES的MTL受體[10]，在LES的收縮中發(fā)生作用，增加LESP[11]。RE患者血清MTL水平較健康人低[12]，且RE患者血漿MTL與LESP正相關(guān)。MTL降低可降低LESP，與RE關(guān)系密切[13]。本研究顯示，食管寧能上調(diào)RE大鼠血漿MTL含量，進而增加LESP，從而治療RE。

LESP下降，胃酸反流入食管致其黏膜損傷。有研究表明GRED中反流的胃液并不直接損傷食管, 而通過刺激細胞因子調(diào)控的炎癥反應(yīng)機制引起食管損傷[14]。GERD是細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng), 并非反流物的直接化學(xué)性損傷。彭林艷等[15]研究認(rèn)為RE患者存在全身炎癥反應(yīng)，RE跟炎癥關(guān)系密切。

IL-17為輔助性T細胞17細胞最主要效應(yīng)因子，其可以誘導(dǎo)IL-6、一氧化氮和前列腺素E2產(chǎn)生，同時上調(diào)TNF-α基因表達，促進局部炎癥進展、擴大[16]。IL-17誘導(dǎo)炎癥方面的功能非常強大[17]。目前IL-17 mRNA表達與RE相關(guān)的報道較少，但是多項研究中都顯示無論與假手術(shù)組還是與正常組相比，RE大鼠食管組織IL-17 mRNA表達均升高；說明在RE發(fā)生發(fā)展中IL-17 mRNA表達有一定作用[18，19]。食管黏膜受到酸反流刺激時活性氧會過量，氧自由基會聚集。食管黏膜損傷與局部氧自由基聚集關(guān)系密切[20]。TNF-α為多核巨細胞產(chǎn)生的細胞因子，在介導(dǎo)炎癥過程、組織損傷等病理生理反應(yīng)中發(fā)揮作用[21，22]。且TNF-α能刺激、誘導(dǎo)中性粒細胞產(chǎn)生活性氧，這種作用與食管黏膜損傷也密切相關(guān)[22]。急性RE大鼠食管黏膜中TNF-α含量會增高[23，24]。此外有研究表明RE大鼠食管組織TNF-α mRNA表達升高，且其表達與RE大鼠炎癥分?jǐn)?shù)正相關(guān)[25]。本研究M組IL-17 mRNA及TNF-α mRNA表達最高，說明M組大鼠炎癥最嚴(yán)重。經(jīng)高、低劑量食管寧治療后的RE大鼠，IL-17 mRNA及TNF-α mRNA表達均較M組低。食管寧可能通過下調(diào)IL-17 mRNA及TNF-α mRNA表達而改善RE炎癥。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)H組的IL-17 mRNA表達與L組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，H組的IL-17 mRNA表達更高，說明低劑量的食管寧抗炎效果更好。

綜上所述，本研究在動物實驗水平驗證食管寧作用于RE大鼠的機制可能與上調(diào)血漿MTL含量、下調(diào)IL-17 mRNA及TNF-α mRNA的表達相關(guān)。